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Purificación de la cruzipaína por cromatografía de afinidad: Su aplicación en el estudio del control de calidad del plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi
Carlos Alberto Labriola Juan José Cazzulo
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Parte I: Purificación de cisteína proteinasas de trypanosomátidos por cromatografía de afinidad. Trypanosoma rangeli es un trypanosoma de América del sur capaz de infectar mamíferos pero aparentemente incapaz de causar patología. Tiene una alta reactividad inmunológica cruzada con Trypanosoma cruzi, el agante de la enfermedad de Chagas. La diferencia principal entre ambos parásitos parece ser la localización de las formas infectivas de T. rangeli en las glándulas salivales, comparada con la localización rectal de los trypomastigotes metacíclicos de T. cruzi, y la aparente pérdida de un estadío intracelular en el mamífero, en el caso del primer parásito. El último punto sugiere que algunos o todos de los diferentes factores postulados a estar involucrados en el reconocimiento, adherencia a, y penetración dentro de la célula de mamífero por los trypomastigotes de T. cruzi, podrían estar ausentes o fuertemente disminuidos en T. rangeli. Entre un número de factores de virulencia propuestos, la cruzipaína, cisteína proteinasa principal de T. cruzi ha sido descripta como una enzima esencial en distintos puntos del ciclo biológico del parásito y podría estar directamente involucrada en la penetración. Por esta razón, decidimos investigar actividades de cisteína proteinasa en epimastigotes de T. rangeli. Hemos purificado cruzipaína a homogeneidad proteica (de T. cruzi) y una cisteína proteinasa (de T. rangeli) utilizando cromatografía de afinidad, tanto en cistatina-Sepharosa, específica para cisteína proteinasas, como en concanavalina-A (ConA), específica para glicoproteínas con oligosacáridos de alta manosa, partiendo de extractos crudos de epimastigotes. La última enzima se expresa a un nivel de dos órdenes de magnitud menor que la cruzipaína en epimastigotes de T. cruzi. Ambas enzimas tienen masa molecular aparente, idéntica secuencia N-terminal y reacción inmunológica cruzada, pero difieren en la secuencia completa y en algunos parámetros cinéticos. Parte II: Control de calidad de plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi. Las N-glicoproteínas son al principio glicosiladas con la transferencia de un oligosacárido (Glc3Man9GlcNAc2, en la mayoría de las células) desde un derivado de dolicol-P-P a un residuo de Asn en el lúmen del retículo endoplásmico (RE). Los oligosacáridos unidos a proteína son procesados en la misma localización subcelular por la glucosidasa I (GI) que remueve la unidad de glucosa (Glc) mas externa y la glucosidasa II (GII) que remueve las dos glucosas remanentes. Un proceso adicional en el RE es la reacción catalizada por la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzima agrega una unidad de Glc a oligosacáridos libres de glucosa en glicoproteínas que no presentan su plegamiento terciario correcto. La GII deglucosila los oligosacáridos monoglucosilados generados por la GT. Las glicoproteínas adquiren su estructura terciaria final en el RE. Las glicoproteínas que fracasan en adquirir su plegamiento correcto son retenidas en el RE y posteriormente transportadas al citosol donde son degradadas en el proteasoma. Por otro lado, las moléculas que se pliegan correctamente pueden continuar su tránsito a través del camino secretorio a su destino final. Se han descripto en el lúmen del RE, dos chaperones no convencionales, calnexina (Cnx) y calreticulina (Crt). Se ha demostrado que la interacción de la Cnx/Crt con glicoproteínas monoglucosiladas facilita el plegamiento de las glicoproteínas en células de mamíferos previniendo la agregación y la supresión de uniones disulfuro incorrectas. Mas aún, la interacción antes mencionada provee uno de los mecanismos por los cuales las células retienen en el RE glicoproteínas mal plegadas. Las interacción Cnx/Crt con glicoproteínas monoglucosiladas fue considerado por lo tanto, como un control de calidad de plegamiento de glicoproteínas. Este modelo predice que la inhibición de la remoción de la Glc agregada por la GT, retardaría (o aboliría) la salida de las glicoproteínas del RE. Esta predicción no puede ser comprobada, sin embargo, en la mayoría de las células dado que la GII es la responsable de la remoción de ambas unidades de Glc unidas en α(1,3). Mas aún, los inhibidores conocidos de GII también inhiben GI. La adición de estas drogas a las células lleva a la acumulación de oligosacáridos con dos o tres Glc que no son reconocidos por la Cnx/Crt. La predicción puede ser comprobada en T. cruzi. Este parásito transfiere “in vivo” oligosacáridos no glucosilados (Man9GlcNAc2) a los polipéptidos nacientes y, por lo tanto, los oligosacáridos monoglucosilados se forman en ellos solamente vía GT. La cruzipaína, una cisteína proteinasa lisosomal de T. cruzi, teniendo tres sitios potenciales de N-glicosilación, al menos dos de los cuales están ocupados, se aisló en la forma glucosilada de células crecidas en presencia de 1-deoxinojirimicina (DNJ), un inhibidor de la GI y GII. El oligosacárido presente en el único sitio de glicosilación del dominio carboxilo-terminal de la cruzipaína se glucosiló en algunas moléculas de enzima pero no en otras, este resultado es consistente con un plegamiento asincrónico de las glicoproteinas en el RE. A pesar de no afectar la velocidad de crecimiento celular o el metabolismo celular general en incubaciones cortas y largas, la DNJ causó un marcado retraso en el arribo de la cruzipaína a los lisosomas. Este resultado es compatible con el modelo propuesto por el cual las glicoproteinas monoglucosiladas podrían ser transitoriamente retenidas en el RE por anclas tipo lectinas reconociendo oligosacáridos monoglucosilados. También se encontró que este protozoo expresa una molécula tipo Crt, el tercer componente (además de GT y GII) del control de calidad de plegamiento de glicoproteínas. No se detectó un gen que codifique para Cnx. La Crt recombinante de T. cruzi reconoció especificamente oligosacáridos monoglucosilados del tipo alta manosa. El agregado de suero anti-Crt a extractos obtenidos de células de un experimento de “pulse-Chase” con [35S]Met más [35S] Cys inmunoprecipitó dos proteínas que fueron identificadas como Crt y cruzipaína. La última proteína pero no la primera desapareció durante el período de “chase”. Contrariamente a lo que sucede en células de mamíferos, la adición de DNJ promovió la interacción Crt-cruzipaína. Este resultado es consistente con la vía conocida de N-glicosilación de proteínas y procesamiento de oligosacáridos que ocurren en T. cruzi y explica el retraso en el arribo de la cruzipaína a los lisososmas causado por la DNJ. El tratamiento de los complejos Crt-cruzipaína con endo-β-N-acetilglucosaminidasa H (Endo H) tanto antes como después del agregado del suero anti-Crt abolió por completo la interacción Crt-cruzipaína. Además, la cruzipaína madura monoglucosilada pero no la no glucosilada aislada de los lisosomas interactuó con la Crt recombinante. Concluimos que la Crt de T. cruzi se une a oligosacáridos monoglucosilados pero no a motivos proteicos en la cruzipaína. Mas aún, las evidencias indican que la GT glucosiló a la cruzipaína en sus últimos estados de plegamiento.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1999 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1999
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