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Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de una plataforma biotecnológica para la obtención y cultivo de células pluripotentes
Jesica Romina Canizo Ramiro Alberio Dante Agustín Paz
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Las células madre embrionarias (ESC) se han utilizado exitosamente desde hace más de 30 años en la transgénesis de ratón y más recientemente en rata para llevar a cabo investigaciones en genética, biología del desarrollo y posibles futuras aplicaciones en medicina regenerativa. Estas células derivadas del macizo celular interno (ICM) del embrión de ratón tiene cuatro propiedades fundamentales que han facilitado su utilización para la modificación genética: 1- pluripotencia, 2- clonogenicidad, 3- capacidad de auto renovación a largo plazo y 4- capacidad de formar quimeras y contribuir a la línea germinal (“quimeras germinales”). Esta última característica permite obtener quimeras de forma muy eficiente: 60 % de animales nacidos vivos en el caso de inyección en blastocistos de ratón y 80 % mediante la agregación de ESC a embriones de 8 células. Las células con estas propiedades se definen como células pluripotentes naïve y se diferencian de otro tipo de célula embrionaria pluripotente derivadas del epiblasto, denominadas células primed (EpiSC). En los últimos años, se han llevado a cabo numerosos estudios para establecer los mecanismos que determinan la pluripotencia naïve durante el desarrollo embrionario temprano y durante la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), aunque en su mayoría se han realizado en ratón y en menor medida en humano. La generación de células naïve bovinas y su utilización para generar bovinos transgénicos requiere entonces trasladar este tipo de estudios. El objetivo general de esta tesis fue estudiar los mecanismos involucrados en la emergencia de la pluripotencia durante el desarrollo embrionario temprano en bovinos y aplicar estos conocimientos al desarrollo de una plataforma biotecnológica para la producción de bovinos transgénicos con fines productivos (molecular pharming) basados en la derivación de células pluripotentes embrionarias y en la reprogramación de células somáticas. Para ello en el primer capítulo se estudió dos condiciones alternativas al medio clásico SOF/BSA para cultivo in vitro de embriones sin suero. El medio N2B27 se estableció como la mejor opción libre de suero para obtener blastocistos bovinos de alta calidad necesarios para estudiar el impacto de la modulación de las vías de señalización y su efecto en la segregación embrionaria. Posteriormente se estudiaron los marcadores de epiblasto e hipoblasto (PE) bovino resultando NANOG y SOX17 los escogidos para evaluar los efectos en la especificación de estos linajes. Adicionalmente se documentó la dinámica de expresión de estos genes durante el desarrollo temprano en embriones de 4 células a blastocitos. La co-expresión comienza al estadio de 8 células, se intensifica en el estadio de mórula y se restringe mutuamente en el de blastocisto. Mediante la detección por inmunofluorescencia se determinó el número de células positivas de cada marcador y con ello se evaluó el efecto de diferentes medios de cultivo sobre la evolución de embriones bovinos producidos in vitro. Se comparó el medio N2B27 t2iGo LIF, utilizado para establecer líneas de células madre embrionarias naïve de ratón y humano, con el control (DMSO), y con el medio al que solo se le agregó h-LIF o t2iGö. Este último es una combinación de PD0325901 y CHIR, inhibidores de MAPK7ERK y GSK3 respectivamente, con la adición de PKC (Gö6983). Del análisis de los resultados se concluyó que el medio N2B27 h-LIF aumentó el número de células NANOG y SOX17 positivas y por tanto del ICM en detrimento del trofoectodermo (TE), lo que indica un efecto en el primer evento de diferenciación embrionaria. A su vez este medio aumentó el número de células que co-expresan NANOG y SOX17. Por otro lado, en el medio N2B27 t2iGö h-LIF se detectaron diferencias en la segregación del epiblasto e hipoblasto de día 8 con un efecto parcial, generando un mayor número de células NANOG positivas en el ICM en detrimento de las SOX17 positivas sin lograr bloquear completamente la formación del hipoblasto. De acuerdo a estos resultados, se cree que existe algún otro mecanismo que junto a la vía MAPK/ERK participa en el embrión bovino para el establecimiento del segundo evento de diferenciación. Para evaluar esta nueva hipótesis, se estudió el efecto de N2B27 suplementado con PD0325901 en una concentración de 10 μM (PD032+), solo y en conjunto con IWP2 el inhibidor de Wnt. Se compararon estos grupos con el control (DMSO) y el medio con solo IWP2. Se ha reportado previamente que la inhibición conjunta de MARPK/ERK y Wnt inhiben el desarrollo del PE en embriones de monos. Inesperadamente nuestros resultados demuestran que PD032+ bloquea la expresión de SOX17 y probablemente la formación del PE, aunque sin el aumento del número de células que expresan NANOG. Este efecto también se observa en la combinación IWP2 + PD032+. Posteriormente, con el fin de establecer si la disminución de las células NANOG positivas se debió a la alta concentración del inhibidor, se llevó a cabo un análisis de la curva dosis respuesta en la que se varió la concentración de PD032 de 2.5, 5 y 10 μM. En todas las concentraciones, se observó la ausencia de células SOX17, en cuanto que NANOG respondió de forma parabólica en la que el número de células positivas es mayor a 5 μM que a 2.5 y 10 y semejante a la del control (DMSO). Al contrario de lo que se esperaba, este resultado en el que no hay un aumento del marcador de un linaje en detrimento del otro nos lleva a pensar que el efecto del bloqueo de SOX17 no se debe a un cambio en la decisión del destino celular. Se necesita profundizar el análisis para determinar la causa de dicho efecto. En el segundo capítulo se evaluaron diferentes metodologías para la generación de iPSC bovinas, tanto aquellas en la que los factores de reprogramación OCT4, KLF4, SOX2 y C-MYC (OKSM) se introdujeron en la célula de forma transitoria mediante episomas, como las que se insertaron en el genoma mediante la transducción de las células con partículas lentivirales. Se realizó en paralelo la reprogramación de células de fibroblastos porcinos (PEF), utilizadas en primera instancia como control del protocolo de reprogramación. Se establecieron las condiciones óptimas en los procesos de transfección de episomas y de generación de partículas lentivirales, previo a la reprogramación. Se trabajó con diferentes medios de reprogramación, el convencional KSR + FGF, el medio E8 de cultivo de células en medio feeder and serum free y el medio SB43 en el que se modulan las vías MAPK/ERK, Wnt y las mediadas por TGF. Se caracterizaron las células obtenidas por inmunofluorescencia de marcadores de pluripotencia nucleares y de membrana, por RT-PCR, actividad de fosfatasa alcalina (AP), detección de la inserción del vector (STEMCCA) en el genoma y expresión de los factores exógenos mediante RT-PCR. Los resultados obtenidos en los experimentos con episomas ponen en evidencia una vez más la dificultad de reprogramar células somáticas en las especies en estudio (bovino y porcino), en los que aún no se han logrado establecer líneas de iPSC genuinas. Por otro lado, haciendo uso de partículas lentivirales en donde la expresión de los genes es constitutiva y suficiente para iniciar la reprogramación, se obtuvieron con mayor facilidad a partir de células porcinas que bovinas, colonias de morfología semejante a las iPSC. Reprogramar células bovinas requirió de la modificación de las condiciones de reprogramación para ajustar los mismos a la cinética de crecimiento de fibroblastos bovinos y a la baja eficiencia con que estos se transducen a una misma MOI con respecto a otras especies. Para ambas especies sigue siendo un desafío establecer el cultivo en forma estable en el tiempo sin que las células varíen sus características. Determinar las condiciones de cultivo que favorezcan la expresión de genes endógenos de la red de pluripotencia e inactiven los exógenos utilizados en los protocolos de partículas lentivirales sigue siendo el cuello de botella en los procesos de establecimiento de iPSC bovinas y porcinas. Como aún no se lograron las células totalmente reprogramadas en estas especies, es fundamental ganar más conocimiento de los mecanismos moleculares de establecimiento de pluripotencia y diferenciación en animales de granja para superar este obstáculo.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
CELULAS MADRE; ANIMALES DE GRANJA; PLURIPOTENCIA; DESARROLLO EMBRIONARIO; MODULACION DE LAS VIAS DE SEÑALIZACION; STEM CELLS; FARM ANIMALS; PLURIPOTENCY; EARLY DEVELOPMENT; MODULATION OF PATHWAYS
Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 2017 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
2017-03-30
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