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En el presente trabajo de tesis se estudió la genética y bioquímica del glutatión en Rhizobium tropici y su relación con la protección frente a estreses ambientales. En nuestro laboratorio previamente se había aislado un mutante GshB‘ de esta bacteria, caracterizado por su sensibilidad a la acidez. En este trabajo se clonó y caracterizó el gen gshB (que codifica para la glutatión sintetasa) salvaje y su región adyacente. Mediante la construcción de fusiones transcripcionales y traduccionales se determinó que la expresión de este gen es independiente de los marcos de lectura contiguos. Asimismo, se encontró que este gen se activa en condiciones de acidez respondiendo a la demanda de mayores niveles de glutatión provocada por la acidificación. Al estudiar los niveles de potasio se observa que la cepa mutante en el gen GshB no aumenta su nivel de potasio interno luego de una acidificación, a diferencia de la cepa salvaje. Se obtuvieron mutantes en un gen que codifica para una proteína de un canal Kef (de eflujo de potasio regulado por el glutatión) de R. tropici, los cuales se caracterizaron. Los estudios que hemos realizado utilizando agentes inductores para canales Kef nos permiten concluir que probablemente exista más de un canal de tipo kef en esta bacteria. Por otra parte, se demostró que la mutación en el gen gshB no modifica la expresión de proteínas de shock ácido inducidas por esta bacteria. Asimismo, se estudió que el glutatión es necesario para la protección frente al estrés oxidativo, posiblemente a través de un mecanismo mediado por un regulador el tipo OxyR de Escherichia coli. Se demsotró que en R. tropici, el glutatión no está implicado en la protección frente al ayuno de nutrientes. Además, se demostró que un mutante GshB’ de Sinorhizobium meliloti 1021, seleccionada por ser una cepa intrínsecamente sensible a los estreses ambientales, el glutatión ejerce un efecto protector frente a dichos estreses, similar a lo observado en R. tropici. Por último se demostró que el glutatión es necesario para el mantenimiento de una simbiosis efectiva en poroto común, protegiendo al nódulo de la senescencia temprana.

Aguerrondo, Inés

Brucella spp. son las bacterias causantes de la brucelosis, la enfermedad zoonótica con más incidencia en el mundo. Brucella es un patógeno exitoso que probablemente infecta animales desde hace millones de años, y se encuentra extremadamente adaptado al estilo de vida intracelular. La virulencia de este patógeno reside en su capacidad de invadir al hospedador, resistir los mecanismos de defensa y, establecerse y replicar en el inhóspito nicho replicativo. El nicho replicativo se caracteriza por ser escaso en nutrientes, tener baja tensión de O2 y someter a Brucella al daño oxidativo. A pesar de que Brucella no posee factores de virulencia “clásicos” posee una batería de mecanismos fisiológicos y adaptaciones metabólicas que en definitiva son los que le permiten sortear las defensas de los hospedadores y adaptarse a la vida intracelular. En este trabajo de tesis, se ha caracterizado y estudiado una parte de la fisiología básica de Brucella, como lo es el metabolismo de las flavinas. Se ha hecho foco en los genes rib, en particular en ribH2 que codifica una enzima lumazina sintasa (LS) que cataliza el penúltimo paso la ruta biosintética de la riboflavina. Se describió la regulación de la expresión de ribH2 por el elemento regulatorio riboswitch FMN, y se identificaron posibles proteínas que interactúan con RibH2 en Brucella. También, se estableció una relación directa entre virulencia y el metabolismo de flavinas en Brucella, resaltando la importancia de RibH2 para la supervivencia, tráfico y persistencia de las bacterias durante la infección en los modelos in vitro e in vivo. El rol de las flavinas en la simbiosis de Rhizobium leguminosarum con plantas, también fue estudiado. Los resultados muestran que el papel que juegan las proteínas RibH2 en el establecimiento bacteriano con el hospedador eucariota no está restricto sólo a Brucella, sino que parece ser compartido por otros Rhizobiales. Los hallazgos de este trabajo de tesis pueden dar lugar a nuevos estudios que lleven al desarrollo de vacunas y drogas contra la brucelosis y mejoras en las cepas bacterianas de inoculantes para uso agronómico.

La cosecha y comercialización del brócoli se realiza en momentos en que la inflorescencia se encuentra en pleno desarrollo. La separación de la inflorescencia de la planta madre detiene el suministro de agua, hidratos de carbono provenientes de la fotosíntesis, otros nutrientes y hormonas, principalmente citocininas, las cuales regulan el proceso de senescencia en la planta, retardándolo. Estos factores, sumados a una alta tasa respiratoria conducen a una senescencia acelerada y rápido deterioro postcosecha del producto. Entre los principales síntomas de la senescencia en brócoli se destaca la ocurrencia de un amarilleamiento de la inflorescencia, consecuencia del inicio del catabolismo de las clorofilas. Se produce degradación de proteínas, disminución del nivel de azúcares solubles y de reserva como el almidón, lo que conlleva al inicio de nuevas vías de obtención de energía como la proveniente de los ácidos grasos de membrana, por lo que las células van perdiendo la permeabilidad selectiva de sus membranas. Asimismo, aumenta el número de especies reactivas de oxígeno y disminuye el poder antioxidante. Dada la importancia de los hidratos de carbono en el inicio de la senescencia y la variación existente en el contenido de los mismos en la planta a lo largo del día, dependiente de los ciclos de luz/oscuridad, en el presente trabajo de tesis doctoral se estudió el efecto de la cosecha a diferentes horas del día (8, 13 y 18 h) sobre la senescencia postcosecha. Se encontraron diferencias en el cambio de color, contenido de clorofilas y de azúcares solubles, así como también en la expresión de genes relacionados al catabolismo de clorofilas. Las muestras cosechadas a la tarde mantuvieron mayores contenidos de clorofila, lo que se reflejó en el mantenimiento del color verde por más tiempo, lo que correlacionó con una menor expresión de genes relacionados a la degradación de clorofila como BoCLH2, BoPPH y BoPaO. Las muestras cosechadas tardíamente fueron las que mostraron mayores niveles de almidón y una disminución menos marcada en el nivel de azúcares solubles. La actividad de enzimas relacionadas tanto al catabolismo de sacarosa como de almidón fue superior en las muestras cosechadas a las 18 h sólo en el día inicial, y se mantuvieron sin diferencias entre las muestras cosechadas a diferentes tiempos durante el almacenamiento. Teniendo en cuenta los resultados anteriores, y para determinar el efecto de los azúcares sobre la senescencia, se realizaron ensayos con un suministro externo de glucosa y sacarosa en brócolis cosechados por la mañana. Se halló que las muestras tratadas mantuvieron un nivel de azúcares más alto hacia el final del período postcosecha, manteniendo el color verde por más tiempo, a la vez que retuvieron mayores niveles de clorofilas, contenido de fenoles y antioxidantes. Se estudiaron también diferentes métodos aplicados en postcosecha para retardar la senescencia, como ser las atmósferas modificadas (AM), tratamientos térmicos (TT) y con 1-metilciclopropeno (1-MCP), de modo de evaluar su efecto sobre la actividad de enzimas involucradas en la degradación de almidón y sacarosa. Se encontró un retraso en el amarilleamiento de las muestras almacenadas en AM, las tratadas térmicamente y aquellas a las que se les aplicó 1-MCP, respecto de las utilizadas como controles. Estas últimas mostraron un descenso más acelerado en el contenido de azúcares, con mayor actividad invertasa y sacarosa sintasa durante el período almacenamiento, y con una menor actividad β-amilasa hacia el final de dicho período.

La ritmicidad comportamental en Drosophila es sostenida por una red neuronal que en el cerebro adulto comprende alrededor de 150 neuronas. Entre éstas, las sLNv han demostrado ser esenciales para el control de la actividad rítmica. Desde el punto de vista circadiano, las sLNv tienen dos características sobresalientes: expresan el neuropéptido PDF, y atraviesan cambios estructurales circadianos en sus terminales axonales, proceso denominado plasticidad estructural. En esta tesis estudiamos qué otros cambios ocurrían concomitantes con la plasticidad estructural. Encontramos que ésta es acompañada por aumentos en el número de sinapsis y disponibilidad de vesículas en momentos de mayor complejidad del árbol axonal, que luego caen durante la fase de menor complejidad. Además demostramos que la plasticidad estructural depende de los niveles de PDF y a raíz de este análisis descubrimos un nuevo rol para PDF durante el desarrollo de las sLNv. La arquitectura adulta de las sLNv necesita que PDF actúe sobre su postsinapsis temprano en el desarrollo larval, proceso que requiere su receptor canónico. Sin embargo, la ausencia de PDF produce defectos presinápticos evidentes luego de la metamorfosis. Comprobamos que previo a la metamorfosis la postsinapsis libera GBB, quien actúa como señal retrógrada sobre las sLNv y promueve el correcto desarrollo del circuito. La ausencia de cualquier componente de la vía de GBB genera defectos semejantes o peores a la ausencia de la vía de PDF. De esta manera revelamos un nuevo mecanismo que provee un “marcado” temprano de blancos sinápticos que guiarán más tarde en el desarrollo el refinamiento neuronal presináptico.

El óxido nítrico (NO) cumple importantes funciones durante la preñez (implantación, decidualización, vasodilatación y relajación miometrial). Sin embargo, en altas concentraciones como las encontradas en los casos de sepsis, el NO tiene efectos tóxicos dado su carácter de radical libre. El objetivo de este trabajo es caracterizar la producción del NO en útero y decidua en la reabsorción embrionaria inducida por lipopolisacárido (LPS) y determinar cuáles son las isoformas de la óxido nítrico sintasa (NOS) implicadas en dicho mecanismo. Se ha observado que el LPS produce un 100% de reabsorción embrionaria a las 24 horas, con una expulsión del feto a las 48 hs. El LPS incrementó la producción de NO en decidua y útero con un máximo en su producción a las 6 horas. Este incremento se debe a la inducción de la expresión de la isoforma inducible de la óxido nítrico sintasa en decidua y útero, y de la isoforma neuronal (nNOS) solamente en decidua que fue detectada por western blot e inmunohistoquímica. El LPS aumentó la expresión de iNOS en decidua y células miometriales y la expresión de nNOS en células de la decidua. El LPS produjo, además, la fibrinólisis y la infiltración de macrófagos iNOS y CD14(receptor de LPS) positivos. Por otro lado, el LPS indujo la expresión de CD14 en las glándulas endometriales que podrían amplificar la respuesta inflamatoria. La Aminoguanidina (AG), un inhibidor de la actividad de la isoforma iNOS, revirtió la reabsorción embrionaria inducida por LPS. Este hecho podría explicarse por una inhibiciónen la producción de NO, pero también podría deberse a una inhibición de la infiltración celular y de la fibrinólisis. El tratamiento con LPS produjo un aumento en el daño oxidativo de la decidua debido al anión peroxinitrito,evidenciado por la nitración de las tirosinas proteicas, hecho que también fue revertido por AG. A su vez, se cuantificó un aumento en la síntesis de prostaglandinas en decidua y útero debido al LPS, pero la AG sólo revirtió el efecto en útero. Estos resultados demuestran que el NO cumple un papel fundamental en la reabsorción embrionaria inducida por LPS.

El óxido nítrico (NO) es un radical libre altamente reactivo, que puede actuar como mensajero intracelular e influir en el desarrollo tumoral. Resultados de nuestro grupo de investigación indican que la expresión de la enzima óxido nítrico (NO) sintasa inducible (iNOS) en tumores vesicales humanos es un factor de mal pronóstico que se asocia con recurrencias más tempranas y con un mayor grado histológico. Teniendo en cuenta que iNOS no se expresa en el urotelio vesical de individuos sanos, y que es una entidad clave del proceso inflamatorio, característico del cáncer de vejiga (CaV), surgió la hipótesis de que la inhibición de esta enzima puede ser un blanco terapéutico para pacientes cuyos tumores expresen iNOS. Para analizar esta hipótesis comenzamos estudiando el rol del NO como consecuencia de la expresión de iNOS, en la progresión del CaV. Para ello utilizamos un modelo murino de CaV que imita muy bien la patología en humanos. Cuando las líneas celulares MB49 y MB49-I son inoculadas en la vejiga de ratones singeneicos generan tumores no invasores del musculo (NMI) y tumores invasores del músculo detrusor (MI), respectivamente. La línea invasora MB49-I, expresa altos niveles de iNOS, y en consecuencia mayores niveles de NO, comparado con la línea MB49. Asimismo, posee incrementados varios pasos del proceso de invasión y metástasis como es su capacidad de migración e invasión, la actividad de enzimas proteolíticas, y la capacidad de generar metástasis pulmonares. Detectamos que el NO es un factor de sobrevida para células de CaV, que expresan iNOS y que al inhibirlo, se reduce la activación de vías de proliferación como la vía de las MAPK, y parámetros de progresión tumoral como la producción de enzimas proteolíticas, migración, angiogénesis y el crecimiento metástatico en pulmón. Analizamos, por otra parte las consecuencias de la inhibición de iNOS en el crecimiento tumoral empleando tres estrategias. La primera fue evaluar la actividad de L-NAME (inhibidor farmacológico pan NOS) de manera sistémica en ratones portadores de tumores de vejiga creciendo en el subcutáneo o en la vejiga de ratones singeneicos. La segunda, fue también una inhibición farmacológica, utilizando el inhibidor específico de iNOS 1400w, en forma local, y la tercera aproximación involucró el silenciamiento genético de la enzima iNOS en la línea invasora. Las tres estrategias mostraron resultados similares demostrando que tanto L-NAME sistémico, como 1400w local y la ablación genética reducen significativamente el crecimiento tumoral de células que expresan iNOS. Asimismo, hemos demostrado que los niveles urinarios de NO, determinados como nitrito, son un marcador de seguimiento en tumores de vejiga, y que la disminución de dichos niveles está asociado a una respuesta a tratamiento. Es así que proponemos que la inhibición de la actividad iNOS sería una terapia promisoria para pacientes cuyos tumores expresen la enzima.

El exceso de andrógenos es uno de los desórdenes endocrinos más frecuentes en mujeres en edad reproductiva y está fuertemente asociada a una reducción en la fertilidad o a infertilidad. En mujeres con esta condición, la administración de glitazonas (como la pioglitazona o rosiglitazona) mejora el perfil androgénico y la función ovárica. La pioglitazona ejerce su acción actuando como ligando del receptor nuclear activado por proliferadores peroxisomales gama (PPARG). Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual el sistema PPARG regula la función ovárica. En este trabajo, en una primera etapa nos planteamos investigar cómo el exceso de andrógenos altera la función ovárica temprana. Encontramos que el hiperandrogenismo indujo una regulación negativa sobre el sistema PPARG y alteró el desarrollo folicular temprano, la vía de la esteroidogénesis folicular estableció un ambiente pro inflamatorio en ovario e incrementó el estrés oxídativo (EO) sistémico. En una segunda etapa nos propusimos investigar si la administración de un ligando de PPARG, la pioglitazona (PGZ,) modificaba o prevenía las alteraciones inducidas por el estado hiperandrogénico. Encontramos que la PGZ activó al sistema PPARG, evitando así la regulación negativa del hiperandrogenismo sobre el sistema PPARG. La activación de PPARG también previno las alteraciones del hiperandrogenismo sobre el desarrollo folicular temprano y la vía de esteroidogénesis folicular, sobre el estado proinflamatorio y sobre el EO sistémico. Colectivamente, nuestros resultados indican que la activación del sistema PPARG en ovario de animales expuestos al exceso de andrógenos mejora la función ovárica temprana, ya que previno las alteraciones sobre la esteroidogénesis folicular, el estatus inflamatorio del ovario y el balance oxídativo sistémico.

El proceso concursal comienza con la sentencia de apertura. La sentencia de apertura de concurso preventivo es el acto jurisdiccional que dispone la designación de síndico por sorteo de una lista de contadores elaborada por la Cámara de Apelaciones en lo Civil y Comercial. En la misma sentencia, el juez indica hasta que fecha quienes se consideren acreedores han de pedir el reconocimiento de su derecho. De igual manera esa sentencia señala el día en que se reunirán los acreedores para considerar la propuesta concordatoria del concursado. Los pretensos acreedores deben entregar su pedido de verificación al síndico, en el domicilio que éste constituyó en la causa, además los acreedores denunciados por el concursado en su demanda reciben carta certificada por la cual toman conocimiento de la apertura de concurso. La etapa de verificación de créditos comienza con la sentencia del artículo 14, porque ese acto jurisdiccional es el que motoriza entre otras cosas el trámite para conformar la masa pasiva. Los pedidos de verificación deben esperar hasta que el síndico que resultó sorteado acepte el cargo, pues recién entonces será síndico del concurso. Éste proceso se divide en dos fases: la fase necesaria la cual no puede faltar porque es impensable un concurso sin conocer la existencia de acreedores y la fase eventual que tiende a corregir la sentencia con que culmina la fase necesaria, es una posibilidad que se le ofrece al concursado y acreedor. El síndico debe estudiar cada solicitud compulsar con la contabilidad del deudor y reunir elementos de juicio que permitan informar al juez, a los acreedores y al propio deudor sobre cada pretensión verificatoria. En la fecha fijada por la sentencia de apertura, el síndico debe presentar el Informe Individual sobre lo créditos el que contiene la opinión del síndico sobre la procedencia o no de cada pedido de verificación. Dentro de los diez días siguientes, el juez pronuncia sentencia y si lo estima procedente declarara verificados los créditos que no merecieron observaciones del deudor, de los acreedores y del síndico. Si hubo impugnación debe declararlo admisible o inadmisible. La declaración de admisibilidad o inadmisibilidad abren la vía al incidente de revisión que puede promoverse dentro de los veinte días siguientes a la fecha de la sentencia de verificación por el cual, el acreedor cuyo crédito fue declarado inadmisible, el concursado respecto de un admisible, los acreedores entre sí, pueden perseguir la revocación de la sentencia que los perjudica. También por la vía incidental pueden recurrir los acreedores que no hubieran pedido su incorporación tempestiva al pasivo (incidente de verificación tardía).

Tesis para obtener el grado de Doctor en en Ciencias Biológicas presentado en la Universidad Nacional de Río Cuarto, en marzo 2019