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La relación entre HIV y las células CD4 positivas en las que replica ha sido ampliamente estudiado. Sin embargo el virus puede asociarse extracelularmente a células CD4 negativas incluyendo los eritrocitos. Si bien se ha reportado que el HIV se une a eritrocitos de individuos HIV negativos in vitro y es capaz de trans-infectar a otras células, no hay estudios equivalentes utilizando eritrocitos de individuos infectados. Esta tesis aporta información sobre la población viral asociada a eritrocitos en pacientes infectados por HIV y del rol que esta población podría tener en la fisiopatología de la infección. En la misma, se demostró la asociación de RNA y antígeno viral de HIV con eritrocitos de individuos infectados cursando distintos estadios virológicos de la infección. Incluso en individuos con carga viral plasmática indetectable por un año en los cuales la detección de antígeno podría ser útil para detectar rebrote de la replicación. Por primera vez se han detectado anticuerpos anti-HIV específicos asociados a eritrocitos. La presencia de los mismos estuvo asociada con replicación viral activa. Se demostró que la capacidad de los eritrocitos de pacientes infectados de capturar virus es muy superior a la de eritrocitos de individuos no infectados. A su vez, se encontró una relación positiva entre esa capacidad de captura y la presencia de anticuerpos anti-glicoproteína sobre la superficie de los eritrocitos. La presencia de HIV y la gran capacidad de captura viral por parte de los eritrocitos de individuos infectados demuestran que pueden ser transportadores de un importante pool viral. Más aun, se demostró in vitro que el virus unido a los eritrocitos conserva su infectividad sobre macrófagos derivados de monocitos, donde la unión mediada por complemento resulta en una infección productiva que genera progenie viral infectiva. Este mecanismo de infección de macrófagos resultó eficaz para una cepa macrofagotrópica pero ineficaz para una cepa linfotrópica pudiendo constituir un factor de selección en las primeras etapas de la infección. Haber determinado la infección de macrófago por el virus asociado a los eritrocitos es relevante dada la característica de aquellas como reservorio y por su capacidad de invasión de distintos tejidos. Los estudios llevados a cabo ponen de relevancia incluir el virus asociado a eritrocitos para comprender cabalmente la dinámica y la fisiopatogenia de la infección. Esto podría conducir a mejorar decisiones clínicas en situaciones tales como inicio o cambios en los tratamientos antirretrovirales así como analizar la posible importancia del virus asociado a eritrocitos como blanco para la terapia antirretroviral.

La línea celular UFL-AG-286 (Anticarsia gemmatalis), utilizada para la producción in vitro del virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV), fue adaptada a tres nuevos medios de cultivo libres de componentes de origen animal, que difieren entre sí en su contenido de esteroles. Las líneas adaptadas presentaron similares cinéticas de proliferación, de consumo de nutrientes y de producción de catabolitos, sólo difirieron en el tamaño. Cuando se ensayó su capacidad para multiplicar AgMNPV, se observó que el virus sólo replicó, y produjo elevados niveles de las dos progenies virales en las células cultivadas en medio con colesterol. En los medios sin colesterol sólo hubo evidencia de efecto citopático en células aisladas. El colesterol resulta esencial para la replicación de AgMNPV en células UFL-AG-286, hay un bloqueo en una etapa temprana del ciclo de replicación, previa a la expresión de los mecanismos de daño celular. Para verificar si la adsorción viral, etapa donde la estructura de la membrana citoplasmática juega un rol central, es modificada por el contenido de esteroles, se realizó una determinación de la cinética de adsorción de AgMNPV sobre todas las variantes adaptadas. Si bien se observaron diferencias en la cinética, posiblemente asociadas a cambios en la estructura de la membrana citoplasmática, el virus fue capaz de adsorberse en todos los cultivos celulares. Por otro lado se evaluó por Resonancia Paramagnética electrónica si la presencia de esteroles y sus diferencias estructurales afectan la fuidez de membrana tanto en membranas modelo como en membranas celulares.

El órgano de Bidder (BO) es una estructura característica de los bufónidos, entre ellos, Rhinella arenarum. Este órgano expresa varias enzimas esteroidogénicas, incluyendo la aromatasa, responsable de la síntesis de estrógenos. En algunos anfibios se propuso que el estradiol (E2) tiene un efecto negativo directo sobre la función testicular, más allá de la regulación de las gonadotrofinas hipofisarias. En este marco, y utilizando como modelo experimental machos de R. arenarum, los objetivos de esta tesis fueron: analizar la capacidad del BO de producir E2 a partir de sustratos endógenos, medir las variaciones estacionales en la concentración plasmática de E2, determinar la presencia del receptor testicular de estrógenos (ER) y analizar el efecto del E2, a lo largo del año, sobre las enzimas esteroidogénicas citocromo P450 17α-hidroxilasa-C17–20 liasa (CypP450c17) y 3β- hidroxiesteroide deshidrogenasa/ isomerasa (3β-HSD/I), sobre la apoptosis y la proliferación. Los resultados obtenidos muestran que los niveles de E2 plasmático son significativamente menores durante el período pre reproductivo (PreR) y que el BO es una de las principales fuentes de E2. Además, se determinó la presencia de ER en testículo. El tratamiento con E2 no modificó ni la actividad ni la expresión del CypP450c17, mientras que se detectó una inhibición significativa de la actividad de 3β-HSD/I durante el período post reproductivo (PostR). Por otra parte, se observó una elevada tasa de proliferación espermatogonial durante el período reproductivo (R) y una marcada apoptosis durante el PostR. El tratamiento con E2 estimuló la apoptosis solo durante el período R y no se observó efecto en la proliferación de la línea espermatogénica. En conclusión, esta tesis describe las variaciones estacionales en el E2 plasmático, la apoptosis y la proliferación testicular, y demuestra que el E2 regula la esteroidogénesis testicular y la espermatogénesis.

Las plantas de maíz (Zea mays L.)perciben la presencia de individuos a través de cambios en la calidad de luz del ambiente (cambios del R/RL)en el que crecen y desencadenan respuestas foto-morfogénicas a fin de reducir el sombreo mutuo. Los fitocromos B1 y B2 estarían involucrados en estas respuestas. Por otro lado los sistemas de producción del cultivo de maíz en alta densidad de siembra promueven desde etapas tempranas cambios en el crecimiento de las plantas (i.e. distinta habilidad competitiva de los individuos), que podrían estar relacionados con su mayor o menor reactividad en percibir vecinos. Se realizaron dos experimentos a campo con una línea de maíz con fitocromos activos (WT)y sus iso-líneas con mutaciones en los fitocromos B1 y B2, en dos densidades de siembra (9 y 30pl m-2, i.e. variación en R/RL). Los objetivos fueron evaluar i)los determinantes del crecimiento de las plantas y del cultivo, ii)el rol de los fitocromos B en las variables medidas, iii)la variabilidad poblacional del crecimiento y iv)la habilidad competitiva de cada línea en poli-culturas (WT/phyB1, WT/phyB2, phyB1/phyB2 y WT/phyB1/phyB2). La línea phyB1 presentó menor altura y diámetro de tallos, menor área foliar y distribución aleatoria de hojas que la WT. La línea phyB2 sólo presentó menor área foliar. El crecimiento de los cultivos, la producción de biomasa y el rendimiento de grano, sin embargo, se vió afectado por ambas mutaciones de fitocromo B, con una penalidad mayor en phyB1 y con un mayor rendimiento de phyB2 en alta densidad de siembra por una mayor fertilidad de las espigas. Por último, ambas mutaciones redujeron la variabilidad poblacional del cultivo y confirieron a las plantas una menor habilidad competitiva en poli-culturas aunque esto no representó una penalidad en el rendimiento del lote por una mayor fijación de granos en la WT.

La progresión clínica de pacientes con cáncer colorectal (CCR) se encuentra asociada a la respuesta inmunológica por lo que estos tumores podrían ser susceptibles a terapias inmunes. Las células Natural Killer (cNK) constituyen importantes efectores anti-tumorales capaces de eliminar células tumorales (CT) sin inmunización previa, mediante el reconocimiento de ligandos presentes en las mismas mediante por receptores activadores e inhibitorios de su función citotóxica. Sin embargo, hasta el momento no está claro el rol que las cNK puedan tener en el control inmunológico del CCR por lo que nos propusimos determinar el impacto de estas células en distintas etapas de la patología tumoral. En este trabajo de Tesis determinamos que las cNK infiltrantes del micro-ambiente tumoral exhibieron un fenotipo profundamente alterado. Co-cultivos de cNK con líneas tumorales demostraron que las mismas son capaces de modular la expresión de receptores y generar una reducción drástica de la capacidad de degranular y producir IFNγ luego de desafío con blancos específicos. Por otra parte, evaluamos cNK de sangre periférica y su posible rol en el control de la diseminación tumoral. Desde estadios tempranos de la enfermedad observamos en las cNK de pacientes una disminución en la expresión de receptores activadores y un aumento de los inhibitorios en referencia a donantes sanos. Este fenotipo inhibitorio afectaría la función citotóxica sobre CT de CCR, siendo TGF-β un mediador soluble presente en alta concentración plasmática posible causante del mismo. Mediante ensayos específicos de bloqueo, observamos que los receptores activadores NKp30 y NKp46 son determinantes de la función lítica de las cNK contra CT de CCR. Además, hallamos una asociación entre la expresión de NKp46 en cNK de pacientes y la sobrevida libre de recaída. Teniendo en cuenta las terapias actualmente administradas para el tratamiento del CCR, evaluamos el impacto de 5-fluorouracilo y oxaliplatino sobre líneas tumorales de CCR y observamos que la exposición al tratamiento incrementa su susceptibilidad a ser lisadas por cNK. Por último, con el objetivo de restaurar funcionalmente las cNK evaluamos el efecto de las citoquinas estimulatorias IL-2 o IL-15 en conjunto con el anticuerpo monoclonal cetuximab. Estas combinaciones mejoraron la citotoxicidad de cNK de pacientes recuperando valores de referencia. Estos experimentos sugieren una posible estrategia de terapias combinatorias para incrementar la actividad de cNK en el contexto del cáncer colorectal.

A nivel internacional, paralelo a la declinación y al colapso de pesquerías de gran escala, surgió un interés creciente por el estudio de las interacciones entre mamíferos marinos y pesquerías. En la mayoría de los ecosistemas marinos, los mamíferos al igual que algunas especies de peces y aves, son considerados predadores tope, con el potencial para el desarrollo de una competencia consuntiva con la pesca por los recursos disponibles. Los estudios dirigidos a evaluar competencia son difíciles de abordar debido a que se requiere conocer los parámetros biológicos y poblacionales tanto de las presas como de los predadores y disponer de series temporales de datos sobre la actividad pesquera. Consecuentemente, hasta que se disponga de información suficiente para desarrollar modelos más adecuados, el estudio del solapamiento trófico entre los mamíferos marinos y las pesquerías provee una buena aproximación del potencial grado de competencia entre ambos. En el Golfo San Matías, desde principios de la década de 1970, se desarrolla una pesquería dirigida al complejo de especies demersales y demersal-pelágicas. De acuerdo a las propiedades oceanográficas y biológicas del golfo, varios estudios han demostrado que algunas de las especies que allí habitan forman unidades demográficas diferentes de las existentes en la Plataforma Continental Argentina, como es el caso de la merluza Merluccius hubbsi. Esta condición de sistema semi-cerrado podría generar escenarios particulares para la interacción entre las flotas pesqueras y los mamíferos marinos. En el marco planteado, se propuso como hipótesis de trabajo la existencia de una potencial competencia por los recursos entre los mamíferos marinos y la pesquería de especies demersales del Golfo San Matías. A partir de esta hipótesis, el objetivo general de la tesis consistió en la identificación y evaluación de potenciales interacciones competitivas, a partir de un análisis de solapamiento trófico, entre las principales especies de mamíferos marinos (delfín común Delphinus delphis, delfín oscuro Lagenorhynchus obscurus y lobo marino de un pelo Otaria flavescens) y las flotas pesqueras (flotas de arrastre, palangre y potera) que operan sobre el conjunto multiespecífico demersal, como base para el desarrollo posterior de modelos trofodinámicos. La dieta del lobo marino de un pelo estuvo caracterizada por el aporte de 24 especies presa, siendo los peces el grupo dominante. La merluza fue la presa más importante, seguida por la raneya Raneya brasiliensis y el savorín Seriolella porosa. El lobo marino de un pelo fue identificado como un predador generalista, con relativamente pocos ítems presa dominantes. Asimismo se lo puede considerar un predador de hábitos mixtos, ya que se alimentó tanto de presas asociadas a la columna de agua como al fondo, y utilizaría los recursos de acuerdo a su disponibilidad en el ambiente. No obstante, en el caso particular de la merluza se planteó la hipótesis sobre un posible subsidio de la pesca de arrastre hacia los lobos, mediante un aumento de la disponibilidad de tallas juveniles de merluza a través del descarte y la reducción del canibalismo por remoción de las tallas adultas. El delfín común y el delfín oscuro basaron su dieta casi exclusivamente en anchoíta Engraulis anchoita, representando más del 80% del total consumido. El calamarete sudamericano Loligo sanpaulensis fue otro componente importante en la dieta. En Patagonia norte, ambas especies de delfines mostraron una estrategia de alimentación mixta. Es posible que estén predando según la disponibilidad de las presas, pero con un cierto grado de selección de acuerdo al comportamiento social de las presas, prefiriendo cardúmenes de especies de pequeño tamaño. Las semejanzas en la composición de la dieta, especies presas y distribución espacial entre el delfín común y el delfín oscuro podrían indicar un alto grado de competencia por los recursos. Sin embargo, si la disponibilidad de alimento es lo suficientemente grande, como parece ocurrir en el ecosistema de Patagonia norte, ambas especies podrían coexistir en el área de simpatría sin desarrollar una competencia consuntiva. El análisis retrospectivo a largo plazo de la pesquería de arrastre de fondo identificó que las fluctuaciones históricas en la composición de los desembarcos habrían respondido a las variaciones en las condiciones macroeconómicas del país, en la demanda y en los precios de los mercados, y a la capacidad de las empresas para hacer frente a estas situaciones. Por el contrario, la disponibilidad de los recursos no habría sido una limitante para el desarrollo del sistema productivo pesquero. A corto plazo, se encontró que las fluctuaciones estacionales en la composición específica de los desembarcos estarían reguladas por los procesos oceanográficos y biológicos que tienen lugar en el golfo. Debido a que la merluza fue la principal especie consumida por el lobo marino de un pelo y la especie blanco de las flotas de arrastre y palangre, en el contexto de la tesis se realizó la primera evaluación global de la biomasa descartada de esta especie por parte de la flota de arrastre que opera en el golfo. Las evidencias indican que el descarte de merluza mostró una tendencia creciente durante la última década, con la posibilidad que sea aprovechado parcialmente por el lobo marino de un pelo para cubrir parte de sus requerimientos energéticos. En las capturas de la flota de arrastre se identificaron 35 grupos de especies. La merluza representó el 72% en número del total de individuos. Esta especie sumada a los restantes grupos con importancia comercial, constituyeron el 90,5% de la captura. De esta forma, la pesquería de arrastre estaría relativamente ajustada a su objetivo. La correspondencia en la estacionalidad de los desembarcos y de las capturas indicaría que la actividad pesquera utiliza los recursos de acuerdo a su disponibilidad en el ambiente. Según la biología de las especies capturadas por la red de arrastre de fondo, en su mayoría corresponden a organismos de lento crecimiento y marcada longevidad, con una estrategia reproductiva compleja. La flota pesquera podría considerarse equivalente a un predador apical del sistema. La merluza también fue la principal especie desembarcada por la flota de palangre, representando entre un 88% y 93% de la captura total. Las tallas capturadas fueron significativamente más grandes que las capturadas por la flota de arrastre, sinónimo de una mayor selectividad del arte de pesca. La estacionalidad en las capturas de la flota palangrera siguió un patrón similar al observado en las capturas y desembarcos de la flota de arrastre, aunque en este caso no hubo una temporada de pesca dirigida específicamente a la captura de savorín. La flota potera dirige su actividad exclusivamente a la captura de calamar Illex argentinus. En 2003, la distribución de tallas de calamar se ubicó en el rango de 23 a 30 cm. A pesar que esta pesquería no operó en los años subsiguientes, comparando las tallas de calamar consumidas por los mamíferos marinos y las capturadas por la flota potera existe el potencial para una interacción entre ambos componentes. El análisis de solapamiento trófico arrojó un valor bajo para la interacción entre la flota de arrastre y los predadores tope estudiados. Al mismo tiempo, la comparación de las tallas de las presas consumidas por los mamíferos marinos y las capturadas por las flotas pesqueras, indicó diferencias en los valores medios. Considerando lo expuesto y en el marco de la hipótesis planteada, se concluyó que la posibilidad de una interacción competitiva entre las flotas pesqueras y los mamíferos marinos, a partir de la utilización de recursos similares, sería baja para el ecosistema del Golfo San Matías.

La sobreexpresión/amplificación del receptor con actividad tirosina-quinasa ErbB-2 define un subtipo agresivo de cáncer de mama (CM) con incidencia elevada de metástasis, denominado ErbB-2 positivo. En esta Tesis revelamos un nuevo sentido de la interacción entre el ErbB-2 y Stat3, otro actor clave en CM, la cual subyace la diseminación metastásica. Encontramos que Stat3 no solo induce la expresión del ErbB-2, sino que también lo recluta como coactivador en el promotor del microARN-21, un microARN promotor de metástasis. El ErbB-2 induce además la expresión del microARN-21 actuando como factor de transcripción. El microARN-21, a su vez, inhibe la expresión de PDCD4, un supresor de metástasis. En la clínica, encontramos en tumores ErbB-2 positivos una correlación inversa entre la coexpresión nuclear Stat3/ErbB-2 y la expresión de PDCD4, la expresión del microARN-21 y de PDCD4, y la expresión de PDCD4 y la presencia de metástasis ganglionares. A pesar de que terapias dirigidas al ErbB-2, como el trastuzumab y el lapatinib, han probado ser beneficiosas, las respuestas tienden a ser limitadas en magnitud y duración. Aquí, describimos un mecanismo de acción novedoso para estos agentes. Encontramos que el trastuzumab y el lapatinib, a través del bloqueo de las vías de PI3K/AKT y MAPK, inhiben al oncogén c-Myc, lo cual aumenta los niveles del microARN-16, un potente supresor tumoral. La incapacidad de inducir la expresión del microARN-16 subyace fenómenos de resistencia. Identificamos a CCNJ y FUBP1 como blancos novedosos del microARN-16, responsables de sus efectos antiprolfierativos, y demostramos que los niveles del microARN-16 y FUBP1 predicen la respuesta al trastuzumab en adyuvancia, en pacientes con CM ErbB-2 positivo. Postulamos al microARN-16 como un agente terapéutico innovador para tumores resistentes al trastuzumab y/o lapatinib.

El retículo endoplasmático (RE) es el compartimiento de varias modificación post-traduccionales y plegamiento de proteínas destinadas a secreción, a membrana plasmática o a organelas del sistema endocítico. Una de las modificaciones post-traduccionales mas frecuentes, la N-glicosilación, está relacionada con el plegamiento de las proteínas ya que sin la adición de N-glicanos, numerosas especies proteicas son incapaces de alcanzar su conformación nativa. Los intermediarios de plegamiento, las proteínas oligoméricas no totalmente ensambladas, las proteínas mal plegadas y los agregados son selectivamente retenidos en el RE. El transporte hacia el aparato de Golgi ocurre solamente cuando las proteínas se han plegado y ensamblado correctamente. El mecanismo que asegura la funcional de las proteínas que salen del RE, ha sido denominado “control de calidad del plegamiento de glicoproteínas". En la mayoría de los eucariotas la N-glicosilación comienza con la transferencia de un oligosacárido de composición Glc3Man9GlcNAc2 desde un intermediario lipídico (dolicol difosfato) a la secuencia Asn-X-Ser/Thr de proteínas nacientes en el RE. Las tres glucosas terminales del oligosacárido transferido son inmediatamente removidas pordos glucosidasas del RE, I y II (GI y GII). Parodi y colaboradores demostraron la existencia de una reglucosilación transitoria de los N-oligosacáridos libres de glucosa dentro del RE por la acción de la enzima luminal UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzima glucosila glicoproteínas, en ensayos libres de células, sólo si éstas han sido previamente desnaturalizadas. Por esta característica especial se ha propuesto a la GT como posible sensor del estado conformacional de las glicoproteínas en el RE. Los oligosacáridos monoglucosilados, que se generan por la deglucosilación parcial por la GI (encargada de remover la glucosa más externa) y GII (encargada de remover las dos glucosas más internas) y por la actividad de la GT, permiten la interacción de las glicoproteínas con dos lectinas del RE, la calreticulina (CRT) y/o calnexina (CNX). Esta interacción facilita el plegamiento de las glicoproteínas, evita la formación de agregados, permite la interacción de las glicoproteínas unidas a CNX con otras chaperonas del RE y constituye un mecanismo para retener en el RE las estructuras proteicas mal plegadas. En la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe existen todos los componentes del modelo de control de calidad de glicoproteínas en el RE, ya que esta levadura expresa actividad GT y posee un homólogo de CNX. Además, el oligosacárido transferido a polipéptidos nacientes es Glc3Man9GlcNAc2 y este compuesto es procesado en el RE a Man9GlcNAc2, indicando la presencia de actividades GI y GII. La disrupción del gen que codifica la CNX en S. pombe ha resultado ser letal para estas células. Sin embargo una mutante deficiente en actividad GT (mutante gpt1) obtenida en nuestro laboratorio no posee ningún fenotipo distintivo. Esto planteó el interrogante de cuál es la importancia y el rol de la formación de oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en estas levaduras. En este trabajo se realizaron además experimentos destinados a analizar si una conformación mal plegada es condición suficiente para para la glucosilación de todos los olgosacáridos N-unidos a proteínas por la GT in vivo, tal como ocurre in vitro. En este trabajo de Tesis se presentan evidencias genéticas de la estructura heterodimérica propuesta para la GII. La GII de S. pombe está compuesta de dos subunidades GIIα y GIIβ. La actividad catalítica está presente en la subunidad GIIα, que carece de señal conocida para permanecer en el RE. La subunidad GIIβ posee en el extremo C-temiinal el tetrapéptido VDEL, homólogo a conocidas señales de retención/recuperación en el lumen del RE. En S. pombe la CNX es esencial para la viabilidad celular. Sin embargo, la disrupción del gen que codifica para GIIα abolió totalmente la formación de oligosacáridos monoglucosilados, tanto por deglucosilación del compuesto transferido a las proteinas como por reglucosilación mediada por la GT. Estas mutantes de S. pombe resultaron viables a todas las temperaturas ensayadas. Esto significa que la CNX y no los oligosacáridos monoglucosilados son esenciales para esta levadura en condiciones normales de crecimiento. Si bien la formación de oligosacáridos monoglucosilados no es esencial para la viabilidad celular, células defectivas total (mutantes GIIα-) o parcialmente (mutantes GIIβ- o GT-) en la formación de oligosacáridos monoglucosilados presentaron una acumulación de proteínas mal plegadas en el RE en ausencia de estrés adicional. Esto se evidenció por la inducción de mensajeros que codifican para chaperonas del RE (respuesta a proteínas mal plegadas o UPR). La acumulación de proteínas mal plegadas en estas mutantes se evidenció además por la presencia en sus glicoproteínas de una mayor proporción de oligosacáridos con estructuras específicas del RE y no del aparato de Golgi. Los glicanos sintetizados por estas mutantes son similares a los obtenidos cuando se agregó a células salvajes un agente reductor que provoca un mal plegamiento en las glicoproteínas que se están sintetizando en el RE. Tal como fue descripto para células de mamifero, en células intactas de S. pombe la formación de oligosacáridos monoglucosilados reduce la velocidad de plegamiento, pero incrementa su eficiencia. Esto fue evidenciado por una comparación de la cantidad de carboxipeptidasa y la velocidad de llegada a la vacuola de esta proteína en células salvajes y GIIα-. Este resultado indicó que los oligosacáridos monoglucosilados están involucrados en la facilitación del plegamiento de las glicoproteínas de S. pombe. La formación de proteínas mal plegadas causada tanto por el agregado de una agente que impide la formación de puentes disulfuro (ditiotreitol) a células intactas, como por un shock de calor, no fueron condiciones suficientes para la glucosilación in vivo mediada por la GT. dichos tratamientos no resultaron en un aumento generalizado de la glucosilación. La explicación para este resultado podría estar en las restricciones de la GT para reconocer sus sustratos: aparentemente la GT sólo glucosilaría glicoproteínas que presentan una estructura parcial o un intermediario del plegamiento con flexibilidad limitada, ausente en las formas completamente desplegadas. Estos resultados sugieren que las glicoproteínas que se pliegan en el RE son sometidas al sistema de control de calidad del plegamiento en las etapas finales del proceso de plegamiento.

Se estudió la composición taxonómica de las comunidades parasitarias de dos especies marinas de peces Atherinopsidae del género Odontesthes en los golfos norpatagónicos, y se estableció el rol que estas especies cumplen como hospedadores de helmintos. Se relacionó también la diversidad de la parasitofauna con las principales características biológicas de los hospedadores (talla, sexo, dieta) y con características ambientales (estacionalidad, áreas de procedencia). Las especies elegidas fueron los pejerreyes Odontesthes smitti y O. nigricans, y las áreas de estudio los golfos Nuevo (GN) y San José (GSJ) en la provincia de Chubut. Estas dos especies superponen sus áreas de distribución y su espectro trófico, y constituyen un ítem presa de importancia variable en la dieta de peces, aves y mamíferos marinos de la región Se examinaron 182 ejemplares adultos de O. smitti de GN y 173 de GSJ. Además, se prospectaron 83 ejemplares de tallas chicas (cornalitos y cornalones) en GN y 65 en GSJ. Se examinaron 105 ejemplares adultos de Odontesthes nigricans de GN y 20 ejemplares adultos de GSJ. El bajo número de O. nigricans en GSJ se explica por la baja capturabilidad de esta especie en GSJ. En O. smitti se hallaron y describieron 17 taxa parásitos: Microsporidia, Cestoda: larvas plerocercoides Tetraphyllidea; Digenea: Prosorhynchoides sp. (Bucephalidae), Aponurus laguncula, Lecithaster sp. (Lecithasteridae), Proctotrema n. sp. (Monorchiidae), Diphterostomum sp. (Zoogonidae); Nematoda: Cucullanus marplatensis (Cucullanidae), Huffmanela moraveci (Trichosomoididae), L3 de Cosmocephalus obvelatus (Acuariidae), L3 de Anisakis sp., L3 de Pseudoterranova sp., L3 de Contracaecum sp. (Anisakidae); Acantocephala: larva cystacanta Corynosoma sp. (Polymorphidae), adulto Echinorhynchida; Crustacea: Bomolochus globiceps (Bomolochidae) y Peniculus sp. (Penelidae). En O. nigricans se hallaron las mismas especies con excepción de Microsporidea, larvas plerocercoides Tetraphyllidea, A. laguncula y Contracaecum sp. Odontesthes smitti y O. nigricans se indican como nuevos hospedadores para la mayoría de los taxa parásitos hallados. Dos especies resultaron nuevas para la ciencia, Huffmanela moraveci y Proctotrema n. sp. El análisis de la distribución de los parásitos en las poblaciones de hospedadores en base a la relación varianza‐ media, el coeficiente de agregación k y el índice de Dispersión de Morisita, mostró que la mayoría de los parásitos están distribuidos de manera agregada en la población de hospedadores. El sexo de los hospedadores no influyó en los valores de prevalencia, intensidad y abundancia de las poblaciones parásitas. Esto sugiere que no existirían diferencias tróficas y/o de comportamiento que afecten a las cargas parasitarias. La longitud de los hospedadores fue uno de los principales factores que influyó en el tamaño de las poblaciones parásitas y en la estructura de las comunidades parasitarias de O. smitti y O. nigricans. La riqueza y la abundancia de las infracomunidades correlacionaron positiva y significativamente con la longitud de los pejerreyes, mientras que la diversidad y la equitabilidad lo hicieron de manera negativa. Esto significa que los hospedadores de longitudes mayores albergaron infracomunidades más ricas, caracterizadas por la presencia de pocas especies bien representadas y varias especies raras. Se evaluó la estructura de las comunidades parasitarias a partir de la correlación de la prevalencia y la intensidad media y la distribución de frecuencias de las prevalencias. En las comunidades de O. smitti de ambos golfos se reconocieron dos especies comunes (Prosorhynchoides sp. y C. marplatensis) de acuerdo a sus altos valores de prevalencia e intensidad media. La similitud cualitativa entre infracomunidades fue alta en GN debido a la presencia de estas especies, y más baja en GSJ debido a la presencia de una mayor cantidad de especies con prevalencias e intensidades intermedias. En O. nigricans no se reconocieron especies centrales y la similitud entre infracomunidades fue baja. La riqueza promedio de las infracomunidades fue marcadamente menor que la de las comunidades componentes, característica de las comunidades insaturadas donde los hospedadores individuales albergan muchas menos especies de parásitos de las que podrían albergar y por lo tanto existen nichos vacantes. Se analizó la composición de la dieta de ambas especies hospedadoras, y se la relacionó con la fauna parasitaria hallada. Como resultado de este análisis, se propusieron las posibles vías de transmisión de los taxa parásitos en los pejerreyes a través de las tramas tróficas en los golfos norpatagónicos. Así, en la comunidad de O. smitti los taxa más prevalentes y abundantes fueron los que utilizan organismos bentónicos como hospedadores intermediarios, indicando una preferencia de O. smitti por alimentarse sobre este tipo de organismos. Por el contrario, en la comunidad parasitaria de O. nigricans predominaron aquellos taxa que emplean hospedadores intermediarios planctónicos, por lo que esta especie hospedadora tendría preferencias por una alimentación con mayores componentes del plancton. Estas diferencias se vieron reflejadas en la estructura de sus comunidades parasitarias. Odontesthes smitti se comporta como hospedador intermediario y/o paraténico para larvas plerocercoides de cestodes Tetraphyllidea y digeneos Bucephalidae constituyéndose en un ítem presa para peces cartilaginosos y teleósteos respectivamente. Además, cumplen el rol de hospedadores paraténicos para larvas de nematodes Acuariidae y Anisakidae y de acantocéfalos Polymorphidae que culminan su ciclo de vida en aves y mamíferos marinos de la región. Odontesthes nigricans cumpliría un rol similar como hospedador intermediario de helmintos en las tramas tróficas de la zona bajo estudio, ya que albergan las mismas especies en estado larval, con la única excepción de las larvas plerocercoides. La presencia de parásitos en estado larval y otros en estado adulto sugiere que las especies hospedadoras se encuentran en un nivel intermedio en las tramas tróficas de la región, además de su importante rol en las relaciones tróficas interespecíficas en el área. Además, se comprobó experimentalmente la infección de los pejerreyes con un digeneo de la familia Monorchiidae a partir de las metacercarias enquistadas en la almeja Darina solenoides. Las comunidades componentes de O. smitti y O. nigricans de los golfos norpatagónicos comparten la mayoría de sus especies parásitas, probablemente por ser especies estrechamente emparentadas filogenéticamente. Diferencias en el comportamiento trófico y en el tamaño corporal serían los factores más importantes a partir de los cuales se podrían explicar las variaciones observadas en la estructura de sus faunas parasitarias.

La supervivencia de los microorganismos en la naturaleza depende de su habilidad para adaptarse rápidamente a los cambios en las condiciones ambientales. Por este motivo, las bacterias han desarrollado estrategias de supervivencia, mecanismos de control activos que les permiten hacer frente a las condiciones adversas y que facilitan el reajuste de la célula a nuevas situaciones. Uno de estos mecanismos es la Respuesta general a estrés que se induce en bacterias Gram-negativas ante distintas condiciones de estrés ambiental, tales como escasez en nutrientes, estrés osmótico, estrés oxidativo y cambios bruscos de temperatura. Los genes involucrados en la resistencia al estrés se encuentran bajo el control de una subunidad sigma alternativa de la RNA polimerasa denominada σˢ, codificada por el gen rpoS. El nivel intracelular de σˢ se regula a nivel transcripcional, traduccional y de estabilidad de la proteína. Otra respuesta desencadenada ante condiciones de estrés es la Respuesta Estricta, que se caracteriza por un aumento en el nivel intracelular de la alarmona (p)ppGpp. Dicha molécula modula la expresión de varios genes, entre ellos el rpoS. Tanto en E. coli como en Pseudomonas se demostró que el ppGpp tiene un efecto positivo sobre la transcripción de rpoS. Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son polímeros de reserva bacterianos cuya acumulación y degradación favorece la supervivencia de los microorganismos en el ambiente. Resultados obtenidos previamente en el laboratorio, demostraron que la degradación del PHA acumulado incrementaba la supervivencia y la resistencia al estrés de la bacteria Pseudomonas putida en microcosmos de agua de río. Teniendo en cuenta estos aspectos, el objetivo general de la presente tesis doctoral fue estudiar el papel de los polihidroxialcanoatos en los mecanismos de repuesta al estrés en P. putida. Para esto se utilizó una cepa salvaje y una cepa con una mutación en la enzima PhaZ, encargada de degradar PHA, y se analizó el contenido intracelular de ppGpp en condiciones de depolimerización de PHA, así como también la resistencia a estrés térmico y oxidativo, y el contenido intracelular de os durante ayuno en carbono. Los resultados obtenidos mostraron que existe un aumento transitorio en el nivel intracelular de ppGpp, aproximadamente 5 hs después del comienzo de la degradación de PHA. No se observó incremento en el contenido de ppGpp en la cepa mutante incapaz de degradar el polímero. La complementación de la mutación phaZ restauró el fenotipo salvaje. Asimismo, se observó que la capacidad de degradación de PHA incrementaba el nivel intracelular de σˢ y la resistencia a estrés térmico y oxidativo durante ayuno en carbono. La introducción del gen que codifica para la depolimerasa de PHA en la cepa mutante phaZ incrementó el contenido de RpoS y la tolerancia al estrés. Estos resultados sugieren que existe una relación entre la depolimerización de PHA y la Respuesta general a estrés controlada por RpoS, que tal vez se encuentre mediada por ppGpp.