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El manganismo es un desorden neurodegenerativo originado por la sobreexposición crónica a Mn, cuyo cuadro clínico y vías de señales se asemejan a los de la Enfermedad de Parkinson Idiopática. El Mn se acumula preferentemente en los ganglios basales y en particular, en las mitocondrias y lisosomas, donde puede generar especies reactivas de oxígeno y afectar las membranas de estas organelas. La permeabilización de la membrana lisosomal (PML) conduce a la liberación de hidrolasas al citosol y a la apoptosis y puede también comprometer la degradación autofágica. En el presente trabajo se investigó el daño lisosomal inducido por Mn y el impacto de este evento en la muerte de las células C6 de glioma de rata. Parte de los resultados obtenidos fueron trasladados a un modelo in vivo de intoxicación aguda con Mn. Por lo tanto, el enfoque estuvo dirigido al estudio de la posible participación de la vía lisosomal en la apoptosis inducida por Mn y al rol potencial de la autofagia en este contexto celular. Los ensayos in vitro se realizaron empleando células expuestas a MnCl2 en distintas condiciones de incubación. Se demostró que el Mn induce un aumento en el tamaño de las vesículas ácidas que puede ser totalmente prevenido por preincubación con antioxidantes. Asimismo, la exposición al metal genera PML y liberación de Catepsina D (CatD) al citosol, procesos que tienen lugar rio arriba de la injuria a la mitocondria. El estudio del rol de las catepsinas en la vía de muerte celular apoptótica demostró que las CatD y B regulan los niveles de expresión de FasL, intervienen en el clivaje de caspasa-8 y Bid y en la activación de la vía de muerte mitocondrial. En este contexto, el Mn activó la autofagia como un mecanismo de supervivencia celular. Los estudios in vivo sugieren que los efectos tóxicos del Mn resultan en un daño a los astrocitos del striatum y en la alteración de los niveles de expresión de la CatD en las neuronas de ciertos ganglios basales involucrados en el manganismo. En conjunto, nuestros resultados demuestran por primera vez que los lisosomas constituyen un blanco estratégico de la toxicidad del Mn, integrando la cascada de señales implicadas en la apoptosis. En este escenario, la autofagia se desencadena en un intento de rescatar a las células de la muerte. Estos hallazgos contribuyen al conocimiento de los mecanismos de daño posiblemente activados en el manganismo y probablemente en otras enfermedades neurodegenerativas.

El objetivo de esta tesis fue en primer lugar, estudiar el rol de las proteína- quinasas activadas por mitógenos (MAPK) en distintas fases de la formación de la memoria en el paradigma de Memoria Contexto–Señal (MCS) del cangrejo Chasmagnathus. En segundo lugar, una vez establecida la participación de estas quinasas en dicho modelo, evaluar su rol en la interferencia sobre la memoria ejercida por péptidos β-amiloide de origen humano en este paradigma de memoria en invertebrados. Se observó activación de ERK 1 h luego de un entrenamiento espaciado (que induce formación de una memoria de largo término [MLT]) en fracciones citosólicas pero no nucleares. Dos entrenamientos control (que no inducen MLT) evidenciaron activación de ERK y JNK citosólicas inmediatamente luego del entrenamiento, decayendo 1 h después. En concordancia, un inhibidor de la vía de ERK1/2 (PD098059) indujo amnesia durante la evaluación de la MLT, solo cuando fue administrado 45 min después del entrenamiento, y no inmediatamente pre- o post-entrenamiento, o cuando se evaluó la memoria de corto término (MCT). Dosis muy bajas de fibrillas de Aβ naturalmente secretadas (FN) impidieron la retención de la memoria solo cuando fueron administradas peri-entrenamiento, e indujeron activación generalizada de ERK/MAPK 1 h luego de su administración. La inyección de péptidos sintéticos de βA1-42 y βA3-42 fibrilados (pero no oligomerizados) resultó amnésica. Sin embargo, no se observó este efecto por administración de βA1-40 o βA11-42 fibrilados. En conclusión, la consolidación de la MLT, a diferencia de su reconsolidación o de la MCT, requiere la fosforilación diferencial de sustratos extra-nucleares de ERK en este modelo. Aβ parece inducir alteraciones fisiológicas y transitorias en el cerebro, más que permanentes y neuropatológicas, dada la especificidad temporal y de vías de señalización implicadas a partir de la administración de bajas dosis de fibrillas. Este efecto específico sobre la memoria está mediado, al menos en parte, por la activación generalizada de ERK que interferiría con la consolidación de la memoria.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Cátedra de Biología Celular, Histología y Embriología. Facultad de Ciencias Médicas.INICSA.CONICET-Universidad Nacional de Córdoba. 2013 - 111 h. + CD. tabls.; grafs.; figus. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

El 75% de los carcinomas mamarios expresan receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP) y son susceptibles a una terapia endocrina. Sin embargo, con el tiempo, algunos pacientes desarrollan resistencia (resistencia hormonal adquirida) y otros no responden al tratamiento desde el comienzo (resistencia constitutiva). En nuestro laboratorio, utilizando modelos de carcinomas mamarios murinos y humanos, hemos demostrado que los tumores respondedores a la terapia con el antiprogestágeno mifepristona (MFP) tienen mayor expresión de la isoforma A del RP (RPA) que de la isoforma B (RPB). A su vez, los tumores con resistencia constitutiva o adquirida, se caracterizan por manifestar la relación inversa (RPB>RPA). Se han propuesto diversas hipótesis para explicar los mecanismos que conducen a la resistencia endócrina, entre ellas, la activación constitutiva de vías de transducción de señales. La vía que involucra al FGF2 y sus receptores está constituida por cuatro receptores (FGFR1-4) y cinco isoformas de FGF2 con distinto peso molecular: la isoforma de 18 kDa o LMW-FGF2 y las de alto peso o HMW-FGF2 de 22; 22,5; 24 y 34 kDa. En trabajos previos demostramos que, en muestras de carcinomas mamarios humanos, existe una asociación significativa entre la expresión de FGFR2 y REα; también observamos una correlación positiva entre la expresión de FGFR1 y un alto grado histológico. Demostramos también que, en tumores sensibles a la terapia endocrina, el FGFR2 activado por el FGF2 estromal participa en el crecimiento tumoral a través de la activación de los RP. Si bien se ha demostrado que la vía del FGF2/FGFR se encuentra desregulada en numerosas neoplasias y patologías del desarrollo, en muestras de pacientes con cáncer de mama aún es controvertida la asociación entre la expresión de FGF2 y el pronóstico de la enfermedad. En base a estos antecedentes, nuestra hipótesis de trabajo es que durante la adquisición de la resistencia endocrina se produce un cambio en la expresión y señalización de FGF2 que favorece el crecimiento y la progresión tumoral. Nuestro objetivo general fue evaluar el rol de la vía FGF2/FGFR en el crecimiento y la progresión del cáncer de mama. En primer lugar, utilizamos el modelo murino de carcinomas mamarios generados en nuestro laboratorio. Observamos, tanto por inmunohistoquímica como por Western blot, que las variantes resistentes de tres familias tumorales diferentes (C4, 59 y C7) expresan mayores niveles de FGFR1 y FGF2 que los tumores sensibles. Por inmunohistoquímica, observamos que el FGF2 se localiza predominantemente en el epitelio o en el estroma tumoral de las variantes resistentes y sensibles, respectivamente. Es interesante observar que, el análisis de la expresión de las distintas isoformas de FGF2 reveló que las variantes resistentes expresan mayores niveles de las isoformas HMW-FGF2 que las variantes sensibles. Asimismo, mediante ensayos de ELISA mostramos que, en los tumores resistentes adquiridos y constitutivos, la localización es mayormente intracelular y extracelular, respectivamente. Luego, evaluamos la funcionalidad de la vía de FGF2/FGFR en cultivos primarios de células epiteliales de las tres familias tumorales. Observamos que el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular de tumores sensibles y resistentes constitutivos, pero no afecta la proliferación celular de los tumores resistentes adquiridos de la familia C4. Por otra parte, el tratamiento con dos inhibidores distintos de FGFR, PD 173074 y BGJ398, inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres familias tumorales, lo que indica un rol proliferativo de esta vía. Sin embargo, al realizar ensayos in vivo con el inhibidor BGJ398, éste sólo reduce parcialmente el crecimiento tumoral de las variantes C4-HI (sensible) y C7-HI (resistente constitutiva). El inhibidor no tuvo efectos significativos sobre el crecimiento tumoral de las variantes resistentes de la familia C4, aunque indujo signos de regresión tumoral temprana en todas las variantes tumorales ensayadas (C4-HI, C4-2-HI, C4-HIR, 59-HI, C7-HI). Las diferencias en el alcance de los efectos observados en cultivo e in vivo sugieren que deben desarrollarse inhibidores con mayor eficacia in vivo. En conjunto, los resultados obtenidos con el modelo murino muestran una correlación positiva entre la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 con la resistencia hormonal y sugieren que, en la progresión tumoral, habría un aumento en la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 en el epitelio tumoral. Este aumento conduce a un cambio de una señalización paracrina en las variantes sensibles, a una autocrina o intracrina en los tumores resistentes constitutivos o adquiridos, respectivamente. A continuación, validamos los resultados en un modelo de cáncer de mama humano, para lo cual utilizamos la línea celular T47D-WT y sus variantes: la línea T47D-YA, con alta expresión de RPA y sensible a MFP, y la línea T47D-YB, con alta expresión de RPB y resistente a MFP. Por inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y Western blot, observamos que la línea T47D-YB expresa mayores niveles de FGFR1, FGFR2 y HMW-FGF2 respecto de la línea T47DYA. Por otro lado, el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular en las líneas T47D-WT e -YA pero no altera su proliferación en las células T47D-YB. La línea resistente presenta mayor actividad basal de la vía de FGF2/FGFR, ejemplificada en la fosforilación de FRS2 y activación predominantemente de la vía de AKT, en comparación con la línea sensible. El LMW-FGF2 modularía principalmente la activación de las vías mencionadas en las líneas T47D-WT e -YA, lo que sugiere una activación constitutiva en la línea resistente. El BGJ398 inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres líneas celulares, indicando que la vía de FGF2/FGFR cumple un rol proliferativo. Finalmente, generamos variantes de la línea T47D-YA que sobreexpresan las isoformas de 18 y 22,5 kDa de FGF2 y evaluamos su efecto sobre la sensibilidad a MFP, TLP y TAM. En ensayos de recuento celular observamos que la sobreexpresión de las isoformas de 18 y 22,5 kDa promovió un aumento en la tasa de proliferación celular y resistencia al tratamiento endocrino en comparación con la línea T47D-YA infectada con el plásmido vacío (T47D-YA-Vac). La resistencia a MFP se mantuvo aún en ensayos in vivo y se observaron signos de malignidad en los tumores primarios, particularmente en la línea T47D-YA-22,5. Esto se evidenció en la capacidad para invadir tejidos adyacentes al tumor, como piel, músculo y tejido adiposo. Si bien algunos de los animales portadores de tumores T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa focos metastásicos en los pulmones, 100% de los ratones con T47D-YA-22,5 presentaron metástasis pulmonares y un mayor número de focos con respecto a T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa. Nuestras observaciones indican que el FGF2 promueve el crecimiento tumoral en ambas variantes, sensibles y resistentes. Sin embargo, los resultados sugieren que, en los tumores sensibles, el estroma proveería el FGF2 que induciría el crecimiento tumoral a través de sus receptores de membrana y el RP de forma paracrina. Por otro lado, en los tumores resistentes, el propio parénquima tumoral expresaría elevados niveles de FGF2 (particularmente LMW-FGF2) y que, a través de un loop autocrino que involucra al FGFR1, gatillaría señales de proliferación, independientemente de la presencia de progestágenos o antiprogestágenos. No descartamos que exista también un loop intracrino, donde el FGF2 intracelular, particularmente las HMW-FGF2, serían responsables de la proliferación celular, resistencia a endocrina y diseminación metastásica. Nuestros estudios contribuyen a esclarecer el rol de las isoformas de FGF2 en la progresión tumoral mamaria y representan la primera evidencia de resistencia hormonal vinculada a HMW-FGF2.

Antecedentes: El cáncer de mama es la neoplasia maligna más común en mujeres y una de las primeras causas de muerte por cáncer en el mundo. A pesar de los avances en el diagnóstico y en el tratamiento para esta enfermedad, un alto porcentaje de los tumores progresan y metastatizan en órganos distantes. PI3K/AKT/mTOR es la vía mutada con mayor frecuencia en tumores sólidos; alrededor del 70% de los tumores de mama presentan alguna mutación en esta vía, lo cual se asocia con un peor pronóstico y resistencia a la terapia endócrina, contra HER-2, radio y quimioterapia. Existen tres isoformas para Akt: AKT1, AKT2 y AKT3, con discrepancias sobre sus funciones específicas. Objetivo: El objetivo de este trabajo fue estudiar el rol diferencial de AKT1 y AKT2 en los procesos de proliferación, migración e invasión celular a lo largo de la progresión tumoral en cáncer de mama. Antecedentes: En trabajos previos del laboratorio utilizando un modelo de carcinomas mamarios murinos habíamos demostrado que la sobreactivación de la isoforma AKT1 era capaz de inducir el crecimiento tumoral hormono-independiente. Los tumores generados resultaron ser más diferenciados que los tumores de los que derivaron, con formación de estructuras ductales y mayor expresión de citoqueratina 8 y laminina I, y menor expresión de citoqueratina 14. Metodología: Para extrapolar los resultados obtenidos en otros modelos experimentales, utilizamos tres líneas celulares humanas de cáncer de mama (IBH-7, IBH-6 y T47D), analizamos el efecto de sobreactivar o silenciar específicamente cada isoforma sobre el fenotipo tumoral en cultivo y en xenotransplantes. Resultados: En las líneas celulares IBH-7 e IBH-6 demostramos que AKT1 induce el crecimiento de tumores mamarios, a través de la activación de la proteína ribosomal S6 y el aumento en la expresión de ciclina D1. Además, la sobreactivación de AKT1 induce el crecimiento tumoral hormono-independiente a través de la fosforilación de receptores hormonales en ausencia de agergado exógeno de hormona. En consecuencia, la sobreactivación de AKT1 fue capaz de inducir resistencia al tratamiento con ICI182780 (Fulvestrant), un antagonista del receptor de estrógenos. Coincidente con los antecedentes mencionados, el fenotipo tumoral obtenido con la sobreactivación de AKT1 es de tipo glandular diferenciado, con aumento en la expresión de las proteínas luminales E-cadherina y laminina-I. Sorprendentemente, el silenciamiento de AKT1 endógeno disminuyó la proliferación e incrementó la migración e invasión celular in vitro a través de la inducción del eje β1-integrina/FAK/MMP9, e in vivo, siendo los tumores resultantes altamente infiltrantes. Por otro lado, la sobreactivación de AKT2 también indujo tumores con características infiltrantes pero sin modificar el crecimiento tumoral. Por el contrario, el silenciamiento de AKT2 endógeno disminuyó la motilidad celular en cultivo, regulando proteínas del citoesqueleto como F-actina y vimentina. El grado de invasión de los xenotransplantes IBH-6 y T47D con distintos niveles de AKT1 y AKT2 se asoció con la pérdida en la expresión de E-cadherina y un aumento en la expresión de vimentina, marcadores de progresión tumoral. Encontramos además que el silenciamiento de AKT1 induce un aumento en la expresión de AKT2 endógeno, sugiriendo una regulación entre isoformas. Por último, en un ensayo preliminar encontramos que el tratamiento con inhibidores de PI3K/AKT/mTOR si bien disminuye el crecimiento tumoral, aumenta la incidencia de metástasis pulmonares. Este resultado puede ser relevante en el diseño de terapias con inhibidores específicos de dicha vía. En conjunto, nuestros resultados muestran funciones diferentes, y en algunos casos opuestas, para AKT1 y AKT2 en la progresión del cáncer de mama. Demostramos que AKT1 tiene un rol relevante en el crecimiento tumoral, regulando proteínas involucradas en la sobrevida y proliferación celular y activando en forma ligando-independiente los receptores hormonales, esto último conlleva a la adquisición de resistencia a la terapia endócrina. En un estadio tumoral más avanzado, tanto la disminución de AKT1 a través de la activación del eje β1-integrina/FAK/MMP9, como el aumento de AKT2 a través de la regulación del citoesqueleto de actina, llevarían a una mayor agresividad tumoral dada por un aumento de la invasión celular. Conclusión: En base a nuestros resultados, proponemos que tanto la pérdida de AKT1 como la ganancia de AKT2 podrían ser consideradas como biomarcadores para clasificar a los tumores mamarios con características más agresivas. La relevancia de nuestro trabajo radica en el análisis exhaustivo de la función de la vía PI3K/AKT/mTOR, diferenciando el rol particular de AKT1 y AKT2 y de sus proteínas target downstream, que a futuro podría aplicarse en el diseño de terapias dirigidas a cada tipo y estadio tumoral para lograr un mayor efecto terapéutico.

La producción de ovocitos y la secreción hormonal en los ovarios determinan la eficiencia reproductiva y en consecuencia, la producción de bovinos de leche y carne. La progresión a través del desarrollo folicular requiere de una comunicación entre el ovocito, las células de la granulosa y las células de la teca; y en dicho intercambio de información participan las citoquinas. El presente estudio fue diseñado para determinar la localización celular específica y expresión de las principales citoquinas y receptores que podrían participar en la enfermedad quística ovárica en bovinos y en la persistencia folicular asociada. El desarrollo del modelo experimentale resultó apropiado para el estudio de los estadios iniciales de la enfermedad así como el desarrollo de la persistencia encontrándose algunas diferencias entre el modelo y los casos espontáneos, las cuales podrían explicarse principalmente por el tiempo de persistencia. Se demostró que existe un posible efecto de las citoquinas en la patogénesis de la enfermedad, balance proliferación/apoptosis y diferenciación celular descriptas previamente en ovarios quísticos. Conociendo la fuerte justificación económica para desarrollar medidas preventivas y tratamientos para las alteraciones foliculares, los resultados obtenidos en esta tesis aumentan el conocimiento de la etiopatogenia de la enfermedad quística ovárica y los mecanismos involucrados en la persistencia folicular proveyendo una invaluable herramienta para estudios adicionales así como para la evaluación de medidas preventivas y terapéuticas.

La producción de ovocitos y la secreción hormonal en los ovarios determinan la eficiencia reproductiva y en consecuencia, la producción de bovinos de leche y carne. La progresión a través del desarrollo folicular requiere de una comunicación entre el ovocito, las células de la granulosa y las células de la teca; y en dicho intercambio de información participan las citoquinas. El presente estudio fue diseñado para determinar la localización celular específica y expresión de las principales citoquinas y receptores que podrían participar en la enfermedad quística ovárica en bovinos y en la persistencia folicular asociada. El desarrollo del modelo experimentale resultó apropiado para el estudio de los estadios iniciales de la enfermedad así como el desarrollo de la persistencia encontrándose algunas diferencias entre el modelo y los casos espontáneos, las cuales podrían explicarse principalmente por el tiempo de persistencia. Se demostró que existe un posible efecto de las citoquinas en la patogénesis de la enfermedad, balance proliferación/apoptosis y diferenciación celular descriptas previamente en ovarios quísticos. Conociendo la fuerte justificación económica para desarrollar medidas preventivas y tratamientos para las alteraciones foliculares, los resultados obtenidos en esta tesis aumentan el conocimiento de la etiopatogenia de la enfermedad quística ovárica y los mecanismos involucrados en la persistencia folicular proveyendo una invaluable herramienta para estudios adicionales así como para la evaluación de medidas preventivas y terapéuticas.

La inflamación es un rasgo característico de la brucelosis humana, presente virtualmente en todos los órganos afectados por la misma. Esta particularidad, junto con la detección de bacterias en los tejidos inflamados, sugiere que Brucella estimula una robusta respuesta inflamatoria en los sitios en que se localiza. Sin embargo, los mecanismos por los cuales estas bacterias desencadenan esta respuesta son hasta el momento desconocidos. A pesar del poderoso potencial inmunomodulador de las lipoproteínas bacterianas, se les ha prestado hasta el momento poca atención en la brucelosis. En esta tesis investigamos la función de las lipoproteínas en el desarrollo de la respuesta inflamatoria asociada a esta enfermedad, poniendo énfasis en la interacción de Brucella con distintos tipos celulares fundamentales en el desarrollo de la respuesta innata. Nuestros resultados demuestran que B. abortus es capaz de inducir la respuesta inflamatoria por medio de la activación y producción de citoquinas en monocitos/macrófagos, células dendríticas y neutrófilos. En relación al componente de Brucella responsable de inducir esta respuesta, nuestras observaciones experimentales indican que las lipoproteínas de Brucella estarían implicadas en el desarrollo de la respuesta inflamatoria en brucelosis.

Muchas especies de animales, entre ellos las serpientes, han desarrollado la capacidad de inyectar o liberar secreciones venenosas con el propósito de controlar, inmovilizar y digerir sus presas. Sin embargo su inoculación por motivos de defensa, es la que ocasiona el accidente ofídico, tanto en humanos como en animales, el cual se presenta como un cuadro fisiopatológico que puede ser fatal. Las especies de serpientes de mayor importancia médica responsables de los accidentes en humanos en el Nordeste Argentino, pertenecen a la familia Viperidae, siendo las intoxicaciones por las especies de Bothrops alternatus y Bothrops diporus las más frecuentes (98%). El envenenamiento por estas serpientes se caracteriza por manifestaciones locales, que se presentan minutos después de la inyección del veneno, tales como dolor intenso, edema y hemorragia local. Estos signos son seguidos por dermo- y mionecrosis, como así también formación de ampollas que rodean al sitio de mordedura. En casos graves provocan alteraciones sistémicas, caracterizadas por hemorragia en órganos y vísceras, coagulación intravascular diseminada (CID) seguida de desfibrinogenación y alteraciones hemodinámicas que pueden llevar a shock cardiovascular, insuficiencia renal aguda (IRA) e incluso la muerte. Entre las manifestaciones, la hemorragia es reconocida como un episodio temprano, frecuente y clave en la clínica del envenenamiento, que conjuntamente a las alteraciones hemostáticas definen la gravedad de la intoxicación. La hemorragia es el resultado de la alteración en la interacción entre plaquetas, factores de la coagulación y la pared vascular, donde el endotelio cumple un papel fundamental. El fenómeno fisiológico que detiene el sangrado se conoce como hemostasia. La respuesta hemostática ha sido clasificada en tres procesos: la hemostasia primaria donde participan fundamentalmente el endotelio y las plaquetas, la hemostasia secundaria que comprende la activación del sistema de coagulación y la fibrinólisis que involucra la degradación de la malla de fibrina. Dado el grado de afectación que inducen los venenos botrópicos en la hemostasia ha cobrado importancia el conocimiento acerca de la manera en que las toxinas afectan el adecuado funcionamiento de la circulación sanguínea y el sistema vascular. De todos los componentes, las metaloproteinasas y las serinoproteinasas de veneno de serpientes (SVMPs y SVSPs, respectivamente) dada su capacidad de clivar el enlace peptídico son las principales involucradas en las alteraciones hemostáticas. Resumen Resumen 2 Van de Velde, Andrea C. Bothrops alternatus conocida como yarará grande o víbora de la cruz es la especie de mayor distribución y abundancia en el NEA y su veneno está constituido en un 43% por enzimas de la familia de las SVMPs, que tienen un rol clave en el envenenamiento. Dado el cuadro de intoxicación inducido por el veneno de B. alternatus y la abundancia de las SVMPs en ésta secreción, fue de interés dilucidar su rol en las alteraciones hemostáticas que desencadena este veneno, como así también la acción sinérgica con otras toxinas involucradas en estas alteraciones. Para discernir la participación de las SVMPs se usaron como herramientas: inhibidores de metalo- (EDTA-Na2) y de serinoproteinasas (PMSF), baltergina (una SVMP P-III hemorrágica), anticuerpos anti-balt y baltergina-DC (fragmento estable de autoproteólisis de baltergina). En primera instancia, se debió aislar y purificar del veneno de B. alternatus la enzima baltergina. La hemorragina purificada se sometió a autoproteólisis previo ajuste de las condiciones óptimas de pH, temperatura y tiempo, para posteriormente llevar a cabo el aislamiento de baltergina-DC. Por otro lado, baltergina fue utilizada como inmunógeno para la producción de inmunoglobulinas G (IgGs) toxino-específico, que junto con EDTA-Na2, fueron empleados para estudios de neutralización del veneno entero. La fracción IgG fue purificada del suero anti-balt por cromatografía de afinidad y estos anticuerpos fueron capaces de neutralizar completamente la actividad hemorrágica y proteolítica (azocaseína) del veneno en una relación 1/20 (veneno/IgGs anti-balt). Como estudios complementarios a los objetivos inicialmente propuestos en esta tesis, fue posible profundizar en la estructura de las toxinas. Mediante estudios de 2D-PAGE de baltergina se observó la presencia de 9 isoformas acídicas (rango de pI= 4,8 - 5,7). Del análisis de espectrometría de masas se logró identificar un 68% de identidad con la secuencia de botropasina, una SVMP P-III aislada del veneno de B. jararaca. Se determinó la secuencia parcial de baltergina-DC, obteniéndose 36 aminoácidos del extremo amino-terminal. Para abordar el efecto de las SVMPs en la hemostasia primaria mediante un ensayo de agregación plaquetaria se demostró que baltergina-DC fue capaz de inhibir la agregación de manera dosis dependiente, observándose una inhibición del 43,65% con la dosis más alta ensayada (50 µg/ml), utilizando ADP como agente agregante. A la vez, se determinó el tiempo de sangría (TS), para ello grupos de animales fueron inoculados con PBS, veneno (20 µg) y veneno pre-incubado con IgG anti-balt (relación 1/30). A las dos horas, los resultados mostraron que el TS de animales inoculados con veneno se prolongó tres veces respecto al control, y en los animales tratados con veneno pre-incubado con anticuerpos toxino-específicos la sangre no coaguló al tiempo y dosis ensayados. Se realizó el recuento de plaquetas en el plasma de los diferentes grupos de ratones y se observó una marcada Resumen Resumen 3 Van de Velde, Andrea C. trombocitopenia en los animales tratados con veneno y veneno pre-incubado con IgG antibalt. A partir de estos estudios se comprobó que las SVMPs del veneno de B. alternatus intervienen en la alteración que induce esta secreción en la hemostasia primaria, específicamente al inhibir la agregación plaquetaria, donde la región símil desintegrina ha de tener un rol clave. Para evaluar el efecto de las metaloproteinasas sobre la hemostasia secundaria se realizaron ensayos tanto in vitro como in vivo. El tiempo de coagulación (TC) fue registrado enfrentando plasma citratado a una solución de veneno, como así también a veneno preincubado con EDTA-Na2, con PMSF y veneno pre-incubado con IgG anti-balt. Los resultados mostraron que el veneno-EDTA-Na2 y el veneno-IgG anti baltergina alargaron 3,5 y 3,1 veces, respectivamente, el TC respecto al control de veneno, mientras que para el venenoPMSF se registró un TC 7,7 veces más prolongado respecto al control. Asimismo se registró el TC sobre fibrinógeno utilizando las mismas muestras y no se observó cambios en el registro del TC en el control de veneno y el veneno inhibido por EDTA-Na2 e IgG anti-balt, sin embargo no se observó la formación de malla de fibrina cuando se expuso el fibrinógeno al veneno-PMSF. Se determinó la concentración de fibrinógeno en plasma citratado de grupos de ratones inoculados por vía i.v. con PBS, veneno (20 y 40 µg) y veneno-IgG antibalt (relación 1/30). Tanto los ratones inoculados con la dosis más alta de veneno como aquellos inoculados con veneno-IgG anti-balt, presentaron un plasma incoagulable lo cual indicó depleción de fibrinógeno circulante. Se comprobó así que las SVMPs afectan la hemostasia secundaria, bajo una acción conjunta con las serinoproteinasas. El alargamiento en el TC observado sobre plasma, y “no sobre fibrinógeno”, por parte del veneno bloqueado tanto con EDTA-Na2 como con IgG antibalt, dejó en evidencia que las SVMPs tienen un rol pro-coagulante. La incapacidad de formar la malla de fibrina por parte del veneno bloqueado con PMSF reflejó el rol exclusivo de las SVSPs con actividad thrombin like. Los ensayos in vivo refuerzan lo observado in vitro. Los anticuerpos no fueron capaces de neutralizar la actividad coagulante del veneno, siendo entonces las SVSPs los principales componentes responsables de provocar depleción de fibrinógeno por consumo. En conclusión, el presente trabajo permite reconocer a las SVMPs como toxinas claves en las alteraciones hemostáticas que pueden conducir a la muerte en el envenenamiento por B. alternatus. Así su responsabilidad directa sobre la hemorragia, sobre la inhibición de la agregación plaquetaria y su contribución en la depleción del fibrinógeno circulante, las vuelve enzimas con una remarcada participación en las alteraciones en la hemostasia Resumen Resumen 4 Van de Velde, Andrea C. inducidas por este veneno botrópico. Los resultados aquí descriptos, conjuntamente a evidencias reunidas de estudios previos, demuestran que los anticuerpos anti-balt serían efectivos neutralizando la hemorragia (tanto local como sistémica), proteólisis de componentes de la matriz extracelular, formación de trombo plaquetario y en general todos los efectos inducidos por las SVMPs. Sin embargo si se utilizaran potencialmente como terapia, la víctima del accidente ofídico tratada con un anti-suero anti-balt se encontraría en un estado anticoagulado transitorio pero sin extravasación de sangre, evitándose con ello la principal causa de muerte por parte de este veneno. Finalmente esta tesis aporta información que podría ser relevante para el diseño de inmunobiológicos más específicos, de baja carga proteica, tendientes a optimizar la actual seroterapia antiofídica.

Muchas especies de animales, entre ellos las serpientes, han desarrollado la capacidad de inyectar o liberar secreciones venenosas con el propósito de controlar, inmovilizar y digerir sus presas. Sin embargo su inoculación por motivos de defensa, es la que ocasiona el accidente ofídico, tanto en humanos como en animales, el cual se presenta como un cuadro fisiopatológico que puede ser fatal. Las especies de serpientes de mayor importancia médica responsables de los accidentes en humanos en el Nordeste Argentino, pertenecen a la familia Viperidae, siendo las intoxicaciones por las especies de Bothrops alternatus y Bothrops diporus las más frecuentes (98%). El envenenamiento por estas serpientes se caracteriza por manifestaciones locales, que se presentan minutos después de la inyección del veneno, tales como dolor intenso, edema y hemorragia local. Estos signos son seguidos por dermo- y mionecrosis, como así también formación de ampollas que rodean al sitio de mordedura. En casos graves provocan alteraciones sistémicas, caracterizadas por hemorragia en órganos y vísceras, coagulación intravascular diseminada (CID) seguida de desfibrinogenación y alteraciones hemodinámicas que pueden llevar a shock cardiovascular, insuficiencia renal aguda (IRA) e incluso la muerte. Entre las manifestaciones, la hemorragia es reconocida como un episodio temprano, frecuente y clave en la clínica del envenenamiento, que conjuntamente a las alteraciones hemostáticas definen la gravedad de la intoxicación. La hemorragia es el resultado de la alteración en la interacción entre plaquetas, factores de la coagulación y la pared vascular, donde el endotelio cumple un papel fundamental. El fenómeno fisiológico que detiene el sangrado se conoce como hemostasia. La respuesta hemostática ha sido clasificada en tres procesos: la hemostasia primaria donde participan fundamentalmente el endotelio y las plaquetas, la hemostasia secundaria que comprende la activación del sistema de coagulación y la fibrinólisis que involucra la degradación de la malla de fibrina. Dado el grado de afectación que inducen los venenos botrópicos en la hemostasia ha cobrado importancia el conocimiento acerca de la manera en que las toxinas afectan el adecuado funcionamiento de la circulación sanguínea y el sistema vascular. De todos los componentes, las metaloproteinasas y las serinoproteinasas de veneno de serpientes (SVMPs y SVSPs, respectivamente) dada su capacidad de clivar el enlace peptídico son las principales involucradas en las alteraciones hemostáticas. Resumen Resumen 2 Van de Velde, Andrea C. Bothrops alternatus conocida como yarará grande o víbora de la cruz es la especie de mayor distribución y abundancia en el NEA y su veneno está constituido en un 43% por enzimas de la familia de las SVMPs, que tienen un rol clave en el envenenamiento. Dado el cuadro de intoxicación inducido por el veneno de B. alternatus y la abundancia de las SVMPs en ésta secreción, fue de interés dilucidar su rol en las alteraciones hemostáticas que desencadena este veneno, como así también la acción sinérgica con otras toxinas involucradas en estas alteraciones. Para discernir la participación de las SVMPs se usaron como herramientas: inhibidores de metalo- (EDTA-Na2) y de serinoproteinasas (PMSF), baltergina (una SVMP P-III hemorrágica), anticuerpos anti-balt y baltergina-DC (fragmento estable de autoproteólisis de baltergina). En primera instancia, se debió aislar y purificar del veneno de B. alternatus la enzima baltergina. La hemorragina purificada se sometió a autoproteólisis previo ajuste de las condiciones óptimas de pH, temperatura y tiempo, para posteriormente llevar a cabo el aislamiento de baltergina-DC. Por otro lado, baltergina fue utilizada como inmunógeno para la producción de inmunoglobulinas G (IgGs) toxino-específico, que junto con EDTA-Na2, fueron empleados para estudios de neutralización del veneno entero. La fracción IgG fue purificada del suero anti-balt por cromatografía de afinidad y estos anticuerpos fueron capaces de neutralizar completamente la actividad hemorrágica y proteolítica (azocaseína) del veneno en una relación 1/20 (veneno/IgGs anti-balt). Como estudios complementarios a los objetivos inicialmente propuestos en esta tesis, fue posible profundizar en la estructura de las toxinas. Mediante estudios de 2D-PAGE de baltergina se observó la presencia de 9 isoformas acídicas (rango de pI= 4,8 - 5,7). Del análisis de espectrometría de masas se logró identificar un 68% de identidad con la secuencia de botropasina, una SVMP P-III aislada del veneno de B. jararaca. Se determinó la secuencia parcial de baltergina-DC, obteniéndose 36 aminoácidos del extremo amino-terminal. Para abordar el efecto de las SVMPs en la hemostasia primaria mediante un ensayo de agregación plaquetaria se demostró que baltergina-DC fue capaz de inhibir la agregación de manera dosis dependiente, observándose una inhibición del 43,65% con la dosis más alta ensayada (50 µg/ml), utilizando ADP como agente agregante. A la vez, se determinó el tiempo de sangría (TS), para ello grupos de animales fueron inoculados con PBS, veneno (20 µg) y veneno pre-incubado con IgG anti-balt (relación 1/30). A las dos horas, los resultados mostraron que el TS de animales inoculados con veneno se prolongó tres veces respecto al control, y en los animales tratados con veneno pre-incubado con anticuerpos toxino-específicos la sangre no coaguló al tiempo y dosis ensayados. Se realizó el recuento de plaquetas en el plasma de los diferentes grupos de ratones y se observó una marcada Resumen Resumen 3 Van de Velde, Andrea C. trombocitopenia en los animales tratados con veneno y veneno pre-incubado con IgG antibalt. A partir de estos estudios se comprobó que las SVMPs del veneno de B. alternatus intervienen en la alteración que induce esta secreción en la hemostasia primaria, específicamente al inhibir la agregación plaquetaria, donde la región símil desintegrina ha de tener un rol clave. Para evaluar el efecto de las metaloproteinasas sobre la hemostasia secundaria se realizaron ensayos tanto in vitro como in vivo. El tiempo de coagulación (TC) fue registrado enfrentando plasma citratado a una solución de veneno, como así también a veneno preincubado con EDTA-Na2, con PMSF y veneno pre-incubado con IgG anti-balt. Los resultados mostraron que el veneno-EDTA-Na2 y el veneno-IgG anti baltergina alargaron 3,5 y 3,1 veces, respectivamente, el TC respecto al control de veneno, mientras que para el venenoPMSF se registró un TC 7,7 veces más prolongado respecto al control. Asimismo se registró el TC sobre fibrinógeno utilizando las mismas muestras y no se observó cambios en el registro del TC en el control de veneno y el veneno inhibido por EDTA-Na2 e IgG anti-balt, sin embargo no se observó la formación de malla de fibrina cuando se expuso el fibrinógeno al veneno-PMSF. Se determinó la concentración de fibrinógeno en plasma citratado de grupos de ratones inoculados por vía i.v. con PBS, veneno (20 y 40 µg) y veneno-IgG antibalt (relación 1/30). Tanto los ratones inoculados con la dosis más alta de veneno como aquellos inoculados con veneno-IgG anti-balt, presentaron un plasma incoagulable lo cual indicó depleción de fibrinógeno circulante. Se comprobó así que las SVMPs afectan la hemostasia secundaria, bajo una acción conjunta con las serinoproteinasas. El alargamiento en el TC observado sobre plasma, y “no sobre fibrinógeno”, por parte del veneno bloqueado tanto con EDTA-Na2 como con IgG antibalt, dejó en evidencia que las SVMPs tienen un rol pro-coagulante. La incapacidad de formar la malla de fibrina por parte del veneno bloqueado con PMSF reflejó el rol exclusivo de las SVSPs con actividad thrombin like. Los ensayos in vivo refuerzan lo observado in vitro. Los anticuerpos no fueron capaces de neutralizar la actividad coagulante del veneno, siendo entonces las SVSPs los principales componentes responsables de provocar depleción de fibrinógeno por consumo. En conclusión, el presente trabajo permite reconocer a las SVMPs como toxinas claves en las alteraciones hemostáticas que pueden conducir a la muerte en el envenenamiento por B. alternatus. Así su responsabilidad directa sobre la hemorragia, sobre la inhibición de la agregación plaquetaria y su contribución en la depleción del fibrinógeno circulante, las vuelve enzimas con una remarcada participación en las alteraciones en la hemostasia Resumen Resumen 4 Van de Velde, Andrea C. inducidas por este veneno botrópico. Los resultados aquí descriptos, conjuntamente a evidencias reunidas de estudios previos, demuestran que los anticuerpos anti-balt serían efectivos neutralizando la hemorragia (tanto local como sistémica), proteólisis de componentes de la matriz extracelular, formación de trombo plaquetario y en general todos los efectos inducidos por las SVMPs. Sin embargo si se utilizaran potencialmente como terapia, la víctima del accidente ofídico tratada con un anti-suero anti-balt se encontraría en un estado anticoagulado transitorio pero sin extravasación de sangre, evitándose con ello la principal causa de muerte por parte de este veneno. Finalmente esta tesis aporta información que podría ser relevante para el diseño de inmunobiológicos más específicos, de baja carga proteica, tendientes a optimizar la actual seroterapia antiofídica.