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El objetivo principal de esta tesis es explorar los efectos producidos sobre una epidemia vectorial debido a los patrones de desplazamiento humanos. En particular se trabaja con la dispersión del virus del Dengue, mediado por el mosquito Aedes aegypti, en una ciudad de clima templado como Buenos Aires. Los análisis se realizan mediante simulaciones numéricas, basadas en modelos computacionales de carácter estocástico y que tienen en cuenta la espacialidad explícitamente. La dinámica poblacional del Aedes aegypti está basada en un modelo preexistente, el cual tiene sólo dos parámetros ajustables: la temperatura ambiental y la densidad de sitios de cría. Sobre este modelo base, se superimpone una dinámica para la movilidad humana, basada en patrones de movilidad observados experimentalmente. Luego se acoplan estas dinámicas poblacionales para permitir la transmisión del virus entre ellas. En primera instancia, se analiza el efecto que produce la elección de los tiempos característicos de los estadios humanos frente al virus. En dichos análisis se considera que los humanos no tienen movilidad alguna. Se observa que la sensibilidad del tama˜no final (cantidad de recuperados totales), la probabilidad de ocurrencia y la duración de las epidemias con la distribución del período de latencia del virus en el humano es baja, sin embargo, el tiempo de aparición del primer caso secundario o también llamado tiempo de generación es sensible a la distribución elegida. Luego se procede a analizar el efecto de los patrones de movilidad humanos. Esto está motivado por la evidencia experimental de la existencia de m´ultiples focos de dispersión en epidemias de Dengue, característica ausente en el caso de modelar la difusión del virus por el vuelo de los mosquitos ´unicamente. La movilidad humana está modelada siguiendo evidencia experimental, la cual sugiere que la distribución de distancias recorridas por los individuos sigue distribuciones de Levy-flight. Los análisis espacio-temporales permiten concluir que la movilidad humana es esencial para la descripción de las epidemias y que los modelos que no la toman en cuenta, solamente permiten describir correctamente el comienzo de la epidemia, sin embargo no permiten predecir el tama˜no final de epidemia ya que lo subestima y no permite explicar adecuadamente la evolución espacio-temporal. Habiendo introducido la movilidad, se analizan posibles intervenciones de importancia en salud publica, destinadas a reducir el impacto de las epidemias. Se consideran básicamente tres estrategias: Restricción de movimiento, que consiste en restringir la movilidad de los individuos sintomáticos. Aislamiento, que los aísla de las picaduras de los mosquitos. Y en tercer lugar fumigaciones, que consisten en la disminución de mosquitos en ubicaciones infestadas. Se observa que la primera de las estrategias es totalmente inefectiva y se recomienda combinar el aislamiento y la fumigación para lograr una mayor eficiencia aún en casos de baja eficiencia individual. Para concluir se analizan sendas situaciones que contemplan escenarios mas heterogéneos espacial y temporalmente. Situaciones donde la densidad de humanos no es homogénea en toda la ciudad, ya sea por la existencia de zonas más densamente pobladas, o por la existencia de un hospital donde concurren los individuos infectados. Además se consideran situaciones donde la resolución temporal del movimiento humano y las picaduras de los mosquitos es mayor a la descripción mínima utilizada hasta este punto.

Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista el cual posee múltiples mecanismos que le permiten evadir la respuesta inmune del huésped y una variedad de factores de virulencia que contribuyen al desarrollo de infección en diversos sitios. Las infecciones por S. aureus se caracterizan por una fuerte respuesta inflamatoria mediada por la presencia de neutrófilos que son reclutados al sitio de la infección. Se ha demostrado el rol crítico de la proteína A (SpA) en el desarrollo de neumonía mediante la inducción de las cascadas de señalización de TNF-α e IFN-β, las cuales conducen a la producción de mediadores inflamatorios y al reclutamiento de neutrófilos. Asimismo SpA induce cascadas de señalización pro-inflamatorias en células mieloides y en células no inmunes. El objetivo general del presente trabajo fue determinar el rol de la proteína A de S. aureus en la activación y secreción de mediadores pro-inflamatorios en neutrófilos humanos así como su capacidad de regular la sobrevida de los mismos. Se demostró que S. aureus y la proteína A contribuyen a modular el perfil inflamatorio de los neutrófilos en forma temprana mediante la inducción de citoquinas inflamatorias y quimioquinas. S. aureus indujo la activación de MAPKs contribuyendo a la producción de IL-8 y TNF-α por los neutrófilos. El estímulo con S. aureus provocó además la expresión sostenida de señales pro-inflamatorias hasta las 22 horas luego de la estimulación. La exposición prolongada de los neutrófilos a S. aureus indujo un aumento en los niveles de mortalidad y cambios en la proporción de neutrófilos apoptóticos/necróticos con un incremento de la proporción de necrosis. No obstante, la expresión de SpA resultó crítica para prevenir parcialmente la necrosis masiva de los neutrófilos favoreciendo la muerte por apoptosis. Nuestros resultados sugieren que la proteína A de S. aureus desempeñaría un rol pro-inflamatorio durante el encuentro inicial con los neutrófilos lo cual contribuiría a la inducción de un microambiente pro-inflamatorio incrementando la sobrevida de los neutrófilos. En estadios posteriores, la expresión de proteína A desempeñaría un rol anti-inflamatorio ya que contribuiría a prevenir la necrosis masiva y disminuir los efectos deletéreos que la inflamación exacerbada podría tener sobre la bacteria.

El crecimiento tumoral resulta de la interacción de la célula neoplásica y su entorno. SPARC “Secreted Protein Acid and Rich in Cystein” es una proteína de matriz extracelular cuya expresión normal se asocia al desarrollo y a tejidos en remodelación. En la mayoría de las neoplasias el aumento de la expresión de SPARC se asocia con un mal pronóstico. Sin embargo, en cáncer de mama la función que cumple la expresión de esta proteína en relación al crecimiento del tumor primario y la diseminación metastásica es controvertida. En este trabajo nos propusimos profundizar las funciones de SPARC, proveniente tanto del estroma como de las células epiteliales en la biología del cáncer de mama. A partir de los estudios realizados con animales transgénicos (SP-/-) que no expresan SPARC en ninguna de sus células, diferentesmodelos de cáncer de mama humanos con distintos niveles de expresión de SPARC, y la cuantificación de la expresión de la proteína en muestras de pacientes con cáncer de mama, determinamos que la expresión de SPARC en ambos componentes tumorales, epitelio y estroma, favorece el fenotipo maligno. Mientras que la elevada expresión en el epitelio tumoral resultó ser más relevante, encontramos que la expresión de SPARC en el estroma tumoral favorece el crecimiento del tumor sólo si el epitelio es negativo. Por otro lado, mediante la utilización del modelo murino 4T1, representativo de un tumor humano estadio IV, pudimos establecer una relación positiva entre la expresión de SPARC y la etapa metastásica de la enfermedad. A partir de la tecnología de microarreglos de ADN, encontramos que SPARC es un importante modulador transcripcional del espacio extracelular y de la proliferación celular, así como también de la respuesta inmune. Finalmente identificamosalgunos genes como posibles efectores de SPARC, favorecedores del crecimiento tumoral y la diseminación metastásica.

El virus de inmunodeficiencia de felinos (FIV) es un lentivirus que causa en gatos domésticos un síndrome de inmunodeficiencia similar al SIDA de humanos. Por ello, el sistema FIV-gato doméstico es considerado un modelo adecuado para el estudio de las infecciones producidas por el virus de inmunodeficiencia de humanos (HIV). El gen gag de FIV, al igual que el del resto de los lentivirus, codifica para el precursor poliproteico Gag el cual se ensambla en partículas virales en la membrana plasmática de la célula infectada. Gag es procesado por la proteasa viral en las proteínas maduras de la cápside: matriz (MA), cápside y nucleocápside. Sin embargo, se desconocía hasta el momento la contribución de cada uno de los dominios de Gag de FIV al ensamblado viral. Con el objeto de estudiar el proceso de ensamblado de FIV, utilizamos el sistema del virus vaccinia para producir la formación de partículas a través de la expresión del gen gag. Los estudios bioquímicos y de microscopía electrónica realizados con células infectadas con este virus vaccinia recombinante demostraron que la poliproteína Gag de FIV se autoensambla en partículas con morfología lentiviral que son liberadas al medio extracelular. Para estudiar el rol de la proteína MA de FIV en la morfogénesis viral, se construyeron virus vaccinia recombinantes lleando mutaciones en este dominio del gen gag de FIV. La caracterización del fenotipo de estas proteínas Gag mutadas llevó a la identificación de dominios en la MA de FIV necesaios para el transporte de Gag a la membrana plasmática y para el ensamblado de partículas virales. Por otra parte, se decidió estudiar la relación estructural y funcional que existe entre la proteína MA de FIV y la del virus de inmunodeficiencia de simios (SIV), caracterizando el fenotipo de ensamblado de virus quiméricos derivados de SIV o FIV, en los que se reemplazó total o parcialmente el dominio MA de un virus por el del otro. El reemplazo total de la MA de SIV por su equivalente de FIV (quimera SIV[MA FIV1-130]) interfiere con el ensamblado de Gag en viriones. La poliproteína quimérica Gag SIV(MA FIV1-130) no se asocia eficientemente a membranas a pesar de miristilarse en igual nivel que el precursor Gag de SIV. El defecto en el ensamblado de la proteína Gag SIV(MA FIV1-130) es revertido por mutaciones que incrementan el carácter básico de la MA de FIV (mutación G31K/G33K) o por la coexpresión con el precursor Gag salvaje de SIV. Esto último indica que la proteína Gag quimérica mantiene la capacidad de establecer interacciones Gag-Gag. Por otro lado, las proteínas Gag quiméricas SIV(MA FIV1-36) y SIV(MA FIV37-130) en las que se sustituyó parcialmente el dominio MA de SIV por la región equivalente de FIV, se ensamblan en viriones con la misma eficiencia que el precursor Gag salvaje de SIV. Sin embargo, estos viriones son incapaces de incorporar la glicoproteína viral de envoltura y resultan significativamente menos infecciosos que el virus SIV salvaje. Finalmente, se construyó el virus quimérico FIV(MA SIV1-130) que contiene la MA de SIV en reemplazo de la de FIV. Este virus quimérico no sólo se ensambla eficientemente en viriones, sino que además es capaz de replicarse en una línea celular linfoidea felina. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis contribuyen así a comprender la homología funcional que existe entre las proteínas MA de lentivirus evolutivamente distantes.

Los iones metálicos están involucrados en todas las fases de la vida y juegan roles primordiales en el crecimiento celular y el funcionamiento metabólico pero pueden ser tóxicos cuando su concentración supera un umbral determinado. En particular, las bacterias han desarrollado sistemas que permiten monitorear estos iones y modular la expresión de factores involucrados en la remoción de los mismos para mantener su homeostasis y prevenir su toxicidad. Salmonella Typhimurium, una enterobacteria capaz de sobrevivir tanto en el medio ambiente como en el hospedador, dispone de sistemas de detoxificación/resistencia específicos, controlados por reguladores transcripcionales que monitorean la concentración intracelular del metal. Entre estos, es de destacar a CueR, que ante la presencia de Cu(I) en el citoplasma induce la transcripción de copA, cuiD y cueP. Los productos de estos genes participan en forma directa y específica en la resistencia al metal. Salmonella dispone además de sistemas no específicos de respuesta a estrés celular que son importantes moduladores de las respuesta global a metales. En este trabajo, vinculamos la resistencia al estrés por Cu con el sistema de fosfotransferencia Rcs de respuesta a estrés en la envoltura. Observamos que este sistema se activa en presencia de concentraciones subletales de Cu provocando la síntesis de la cápsula de ácido colánico en la cepa sensible a Cu ΔcuiD. Determinamos que el sistema Rcs confiere resistencia al Cu y que la sobreexpresión de CueP impide la activación de dicho sistema provocada por Cu Por otro lado, demostramos la participación del sistema de dos componentes CpxAR de respuesta a estrés periplasmático, que junto con CueR regulan transcripcionalmente la expresión de cueP. Estudiamos los aspectos mecanísticos de esta co-regulación y analizamos su relevancia fisiológica para la sobrevida en condiciones de estrés. Finalmente, identificamos nuevos componentes en el locus cueP; un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de 3,5 kDa que denominamos CueQ y que es cotranscripta junto a cueP, y un ARN regulatorio codificado en cis que afecta específicamente la traducción de cueQ dentro del operón.

Los iones metálicos están involucrados en todas las fases de la vida y juegan roles primordiales en el crecimiento celular y el funcionamiento metabólico pero pueden ser tóxicos cuando su concentración supera un umbral determinado. En particular, las bacterias han desarrollado sistemas que permiten monitorear estos iones y modular la expresión de factores involucrados en la remoción de los mismos para mantener su homeostasis y prevenir su toxicidad. Salmonella Typhimurium, una enterobacteria capaz de sobrevivir tanto en el medio ambiente como en el hospedador, dispone de sistemas de detoxificación/resistencia específicos, controlados por reguladores transcripcionales que monitorean la concentración intracelular del metal. Entre estos, es de destacar a CueR, que ante la presencia de Cu(I) en el citoplasma induce la transcripción de copA, cuiD y cueP. Los productos de estos genes participan en forma directa y específica en la resistencia al metal. Salmonella dispone además de sistemas no específicos de respuesta a estrés celular que son importantes moduladores de las respuesta global a metales. En este trabajo, vinculamos la resistencia al estrés por Cu con el sistema de fosfotransferencia Rcs de respuesta a estrés en la envoltura. Observamos que este sistema se activa en presencia de concentraciones subletales de Cu provocando la síntesis de la cápsula de ácido colánico en la cepa sensible a Cu ΔcuiD. Determinamos que el sistema Rcs confiere resistencia al Cu y que la sobreexpresión de CueP impide la activación de dicho sistema provocada por Cu Por otro lado, demostramos la participación del sistema de dos componentes CpxAR de respuesta a estrés periplasmático, que junto con CueR regulan transcripcionalmente la expresión de cueP. Estudiamos los aspectos mecanísticos de esta co-regulación y analizamos su relevancia fisiológica para la sobrevida en condiciones de estrés. Finalmente, identificamos nuevos componentes en el locus cueP; un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de 3,5 kDa que denominamos CueQ y que es cotranscripta junto a cueP, y un ARN regulatorio codificado en cis que afecta específicamente la traducción de cueQ dentro del operón.

La Proteína Secretada Acídica y Rica en Cisteínas (SPARC en Ingles) ha sido asociada con efectos pro- y anti-angiogénicos. En esta tesis inicialmente se ensayó la actividad de la proteína SPARC de diferentes fuentes y todas fueron capaces de inhibir la proliferación, adhesión y migración de células endoteliales. SPARC obtenida de melanoma produjo un efecto bifásico en la proliferación de fibroblastos, aunque sobre las células tumorales no demostró efectos detectables. Por otro lado, SPARC fue capaz de modular la migración de células endoteliales inducida por factores angiogénicos como VEGF y PDGF. A bajas concentraciones SPARC estimulo la migración de las células endoteliales y a altas la inhibió. En esta última condición dicho efecto estuvo acompañado por el incremento en la capacidad de inducir la diferenciación de las células endoteliales, independientemente de los factores presentes en el medio. Además, encontramos que los niveles de SPARC disminuyen en hipoxia sugiriendo que la modulación de los niveles de SPARC por la tensión de oxigeno sería responsable de los efectos moduladores de la angiogénesis tumoral. Nuestros datos demuestran que SPARC puede actuar como un factor proangiogénico o anti-angiogénico en función de su concentración y los factores con los que interactúa. Hemos demostrado que tiene un rol único en la modulación de la angiogénesis tumoral actuando sobre la diferenciación, migración y proliferación de las células endoteliales.

El objetivo principal de esta Tesis fue profundizar el estudio de los mecanismos bioquímicos involucrados en la transición dimórfica de Candida albicans. Este trabajo está basado en resultados previos de nuestro laboratorio en los que se había demostrado que la vía de señalización del AMPc está involucrada en la respuesta del hongo a algunos de los factores ambientales que controlan su morfología. En consecuencia, continuamos nuestra investigación enfocando el estudio en la participación de la enzima blanco del AMPc, la quinasa de proteína dependiente de AMPc (PKA), en Ia transición levadura —>micelio. Los resultados de los experimentos realizados in vivo con la cepa salvaje 1001 demostraron que: - La inhibición in vivo de la actividad de PKA utilizando inhibidores específicos resultó en un bloqueo completo de la transición dimórfica en medio mínimo cuando la inducción se llevó a cabo con NAcGlc. Cuando el inductor usado fue suero, la inhibición de la PKA no tuvo un efecto tan drástico. - La inhibición de la PKA no promovió efectos deletéreos en la célula ya que el agregado de suero pudo reiniciar la diferenciación en células bloqueadas ni produce efectos generalizados sobre el crecimiento ya que la gemación de las células levaduriformes no fue afectada. - La inhibición de la PKA resultó en un bloqueo generalizado de la fosforilación total de proteínas in vivo. EI agregado de dbAMPc al medio aumentó globalmente la fosforilación de proteínas y aún en su presencia la inhibición de la PKA promueve una desaparición completa de las proteínas fosforiladas. Estos experimentos permiten concluir que la PKA es un elemento crucial en la transducción de señales desencadenadas por NAcGlc y que su ubicación en la cascada de fosforilaciones es tal que controla otras quinasas, algunas de las cuales podrian estar involucradas en el dimorfismo. Los experimentos de germinación realizados con una mutante que carece del gen para la única subunidad catalítica (subunidad C) conocida hasta ese momento (gen TPK2), y los datos aportados por el Proyecto genoma de Candida , permitieron demostrar la existencia y expresión de un segundo gen para C no conocido. Es más, esta nueva C tiene también un rol positivo en la diferenciación. Demostramos también que la subunidad R es una fosfoproteína in vivo. La autofosforilación de la subunidad R resultó en una marcada disminución de su afinidad por C Io que hizo a la holoenzima mas sensible a disociación por AMPc. In vivo esta situación permitiría a la holoenzima ser disociada con pequeñas fluctuaciones de AMPc.

Fernández, E. R. (2014). Rol de la respuesta inmune específica contra el Trypanosoma cruzi y la progresión de la enfermedad cardíaca en pacientes chagásicos crónicos. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

La Glucosidasa II (GII) cumple un rol fundamental en la biogénesis de glicoproteínas en el retículo endoplásmico (RE). Es responsable por la remoción secuencial de los dos residuos de glucosa (Glc) más internos del glicano (Glc3Man9GlcNAc2) transferido a los residuos de Asn en las glicoproteínas nacientes en la vía secretoria. GII participa en los ciclos de Calnexina (CNX)/Calreticulina (CRT) ya que remueve el residuo de Glc agregado a intermediarios de plegamiento por la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT). La GII un es un heterodímero soluble del RE cuya subunidad α (GIIα) posee el sitio catalítico mientras que el rol de la subunidad β (GIIβ) es controvertido, si bien ha sido involucrada en la retención en el RE de GII y en el plegamiento de GIIα. En esta tesis demostramos que en ausencia de GIIβ, la subunidad catalítica GIIα de la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe (un organismo que posee un mecanismo de control de calidad de plegamiento de proteínas similar al presente en células de mamíferos) adopta una conformación activa y es capaz de hidrolizar el análogo de sustrato p-nitrofenil-α-D-glucopiranósido. Sin embargo GIIβ es necesaria para la correcta localización de GII en el RE y para la deglucosilación eficiente de los sustratos fisiológicos Glc2Man9GlcNAc2 y Glc1Man9GlcNAc2. El dominio homólogo al dominio lectina del receptor de Manosa 6-fosfato presente en el C-terminal de GIIβ interacciona con manosas en las ramas B y/o C de los N-glicanos mediando la hidrólisis del sustrato por GIIα. Demostramos, también, que el dominio G2B del N-terminal de GIIβ es necesario para la interacción GIIα-GIIβ. Por último, demostramos que una reducción en el contenido de manosas de los N-glicanos disminuyó significativamente la deglucosilación in vivo mediada por GII pero no afectó la glucosilación in vivo mediada por UGGT, favoreciendo la formación de derivados monoglucosilados. Esto sugiere que GII funcionaría como un regulador de la permanencia en los ciclos de CNX/CRT de las glicoproteínas que se pliegan muy lentamente, y por lo tanto han sido demanosiladas, otorgando más oportunidades de plegamiento a las proteínas antes de enviarlas a degradación.