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Fil:Souto, Sara. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Los hidratos de carbono participan en eventos de reconocimiento que inician la respuesta inmunológica a infecciones bacterianas o virales y en procesos relacionados con la inflamación y metástasis. Nuevos glicomiméticos, que son útiles para investigar dichos procesos, se sintetizan comúnmente por reemplazo en un azúcar de átomos de oxígeno por átomos de carbono u otros heteroátomos. Así, el reemplazo de uno o más átomos de oxígeno del enlace interglicosídico de un oligosacárido por átomos de azufre produce tiooligosacáridos. Esta modificación induce algunos cambios en sus propiedades; por ejemplo, suelen resistir la acción de enzimas hidrolíticas y actuar como inhibidores de las mismas. La inhibición de glicosidasas es fundamental para la terapia de numerosas enfermedades y los tiooligosacáridos son valiosos inhibidores por ser tolerados por la mayoría de los sistemas biológicos. En vista de las interesantes actividades biológicas de los tiooligosacáridos, se planteó como objetivo general de este trabajo el diseño y síntesis de tiodisacáridos y tiotrisacáridos. Estas moléculas se diseñaron de modo que contuvieran azúcares biológicamente importantes, como glucosa o galactosa, como extremo no reductor. Para la construcción del enlace S-interglicosídico se emplearon enonas de azúcares o sus derivados, unidades que quedaron localizadas en el extremo reductor del tiooligosacárido. Las enonas se utilizaron como aceptores de Michael de 1-tioaldosas, o como precursores de epóxidos y tiiranos de azúcares. La apertura nucleofílica por 1- tioaldosas de estos anillos de tres miembros se describe como un nuevo procedimiento para la síntesis de tiodisacáridos (a partir de epóxidos) o de tiotrisacáridos (a partir de tiiranos). Se logró así la construcción del enlace tioglicosídico regio- y estereoselectivamente. Los nuevos compuestos se evaluaron como inhibidores de la β- galactosidasa de Escherichia coli, enzima modelo útil en el estudio de glicosidasas. Se obtuvieron inhibidores competitivos, no competitivos y mixtos con valores de Ki en el rango de 0,1 mM.

En el área de la glicobiología la búsqueda de nuevos inhibidores enzimáticos ha conducido al desarrollo de glicomiméticos como, por ejemplo, los tiooligosacáridos. Éstos son análogos de oligosacáridos naturales en los cuales el átomo de oxígeno interglicosídico se ha sustituido por azufre y suelen ser reconocidos por enzimas e inhibir su actividad biológica. Dado que prácticamente no se encuentran ejemplos de tiodisacáridos y tiooligosacáridos de azúcares furanósicos, se planteó como objetivo general de esta Tesis el diseño y síntesis de tiodisacáridos constituidos por al menos una unidad pento o hexofuranosa y su evaluación como inhibidores de una β‐galactofuranosidasa de Penicillium fellutanum. La galactofuranosa es constituyente de polisacáridos de micobacterias como el Mycobacterium tuberculosis, causante de la tuberculosis. La Galf es esencial para la sobrevida o virulencia de varios microorganismos patogénicos, pero por el momento no se ha encontrado en mamíferos. Dado que la degradación de glicoconjugados de Galf en algunos microorganismos es resultado de la acción de una β‐galactofuranosidasa, ésta es un blanco adecuado para la acción de inhibidores. Por las razones enunciadas precedentemente, en este trabajo se desarrollaron metodologías generales de síntesis de tiooligosacáridos de azúcares furanósicos, en particular de Galf. Como paso clave para la construcción diastereoselectiva del enlace tioglicosídico se emplearon: i Adiciones conjugadas de 1‐tioaldosas a azúcares aceptores de Michael; ii Reacciones de trans‐tioglicosilación; iii Reacciones de sustitución nucleofílica y iv Reacciones de apertura de tiiranos de azúcares. Así, se han obtenido tiodisacáridos con unidades furanósicas localizadas tanto en el extremo reductor como el no reductor. También se presenta una síntesis satisfactoria de un tiodisacárido formado por dos azúcares furanósicos. Asimismo, se ha descrito una nueva metodología, basada en la apertura de tiiranos de azúcares por una 1‐tioaldosa, para la construcción de ditiotrisacáridos ramificados con unidades furanósicas.

Las Tiorredoxinas (Trxs) son proteínas que se encuentran en todos los sistemas biológicos y poseen una secuencia muy conservada Cys—Gly-Pro—Cys cuyos tioles reducen los puentes disulfuro de una gran variedad de proteínas. En los cloroplastos de los organismos fotosíntéticos oxigénicos la reducción mediada por la Trx modula la actividad proteica ya que este proceso promueve un cambio conformacional en la enzima sustrato. En esta organela se han caracterizado dos Trxs filogenéticamente distantes: la Trx-m tendría un origen procarióticol mientras que la Trx-f presenta gran homologia con la Trx humana. La Trx-f es particularmente eficiente en la modulación in vitro de la actividad la fructosa-1,6-bisfosfatasa (cFBPasa), mientras que la Trx—m es ineficaz. La disponibilidad de las estructuras tridimensionales de las Trxs de diferentes organismos, su pequeño tamaño, gran solubilidad y termoestabilidad hacen de esta proteína un modelo interesante para el estudio de sus características conformacionales. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue caracterizar estructural y funcionalmente a la Trx— m, y compararla con la Trx de Escherichia coli. La Trx bacteriana se tomó como referencia ya que ha sido ampliamente estudiada y presenta además un alto porcentaje de identidad con la Trx—m.Por otra parte, si bien todas las Trxs comparten el mecanismo catalítico (el intercambio tiol-disulfuro) interaccionan con diferentes proteínas. Las interacciones no covalentes previas a la formación del disulfuro mixto serían las que determinan la especificidad de la Trx por los diferentes sustratos. En este sentido, se analizó la contribución de las interacciones electrostáticas en el reconocimiento Trx-m . cFBPasa. Para realizar estos estudios se aisló la secuencia codificante de la Trx—m de Brassica napus (colza), se sobreexpresó en un sistema heterólogo y se purificó la proteína recombinante. Los aspectos estructurales y funcionales se analizaron mediante mutagénesis sitio-dirigida. A pesar de la gran homología estructural que tienen la Trx—m y la Trx de E. coli, casi todos los estudios realizados mostraron que poseen diferencias fisicoquímicas y funcionales. La Trx—m fue menos eficiente que la Trx de E. coli en la reducción e isomerización de puentes disulfuro. Por otra parte, si bien las Trxs son muy termoestables la Trx—m es aún más estable que la Trx bacteriana. La mutante W17F Trx-m, que conserva los dos triptofanos próximos a las cisteínas catalíticas, permitió establecer que a pesar de que la Trx-m y la Trx bacteriana mantienen la geometría del sitio activol el entorno de estos triptofanos es distinto. Tanto la Trx—m salvaje como la mutante W17F tienen un rendimiento cuántico menor que la proteína bacteriana y la dependencia de la fluorescencia intrínseca con el pH también es distinta. Por otra parte, la mutante Wl7F permitió identificar que el triptofano l7 en la Trx-m es el residuo que más contribuye a la emisión de la fluorescencia intrínseca de la proreína oxidada y contribuye también al espectro de dicroismo circular en el UV lejano. La importancia del triptofano 17 en el núcleo aromático de la proteína se determinó con el reemplazo por un residuo alifático y pequeño (WWA). Esta mutante modificó no sólo las propiedades estructurales (fluorescencia intrínseca y dicroismo circular en el UV lejano) sino también la estabilidad frente a perturbantes físicos y químicos. y la capacidad reductora (insulina y cFBPasa). La prolina en la posición 35 está estrictamente conservada en las Trxs-m y ausente en todas las otras. El reemplazo de esta prolina aumentó la sensibilidad de la molécula a perturbantes químicos y fisicos. La incorporación de una carga positiva en esa posición (P35K) favoreció la interacción con la cFBPasa, mientras que una carga negativa la empeoró (P35E). Estos resultados son congruentes con la densidad de cargas negativas que rodea a las cisteínas de la cFBPasa sujetas a la regulación redox y al contenido de cargas positivas que rodea el sitio activo de la Trx—f,el modulador más eficiente. Por otra parte. altas concentraciones salinas condujeron a todas la Trxs a valores similares de activación. Como conclusión, la cFBPasa discriminaría a las distintas Trxs por interacciones electrostáticas de largo alcance, que determinarían la diferente eficiencia de las Trxs en la modulación de la actividad de esta enzima. Sin embargo, las interacciones electrostáticas no influirían en la interacción entre la Trx y la malato deshidrogenasa, ya que todas las mutantes en la Pro35 resultaron menos eficientes en la acrivación que la Trx-m salvaje El conjunto de estos resultados no sólo establece la participación de las interacciones electrostáticas sino también revela la contribución de otros factores en la formación del complejo no covalente (Trx-m)reducida/(proteína sustrato)oxidada.

Tesis presentada para la obtención del título de Máster en Ciencias Agropecuarias Mención Economía y Desarrollo Rural, presentada en la Universidad Nacional de Río Cuarto, Facultad de Agronomía y Veterinaria en Septiembre de 2017

La leishmaniasis tegumentaria americana (LTA) es una enfermedad protozoaria causada por parásitos del género Leishmania que se transmiten a través de la picadura de flebótomos hembras. La LTA es endémica en diez provincias de Argentina, siendo el departamento de Orán la región más comprometida en la provincia de Salta (Salomón et al., 2008, Krolewiecki et al., 2017). La zona se caracteriza por la prevalencia de Leishmania (Viannia) braziliensis cuyo vector putativo es Nyssomyia neivai, la especie de flebótomos más abundante, y los reservorios se desconocen hasta el momento (Salomón et al., 2004, Marco et al., 2005).El área de estudio de esta tesis fue el departamento de Orán. A lo largo de los años 2015, 2016 y 2017 se capturaron flebótomos en siete sitios periurbanos y rurales para búsqueda de infección natural, la tipificación molecular de flebótomos y parásitos y el estudio de la abundancia estacional de las especies capturadas.Inicialmente, se analizó la variación estacional de las hembras capturadas en dos sitios periurbanos colindantes a parches de vegetación secundaria, emplazados en zonas con reporte de casos humanos de LTA. La abundancia media estacional de las hembras capturadas se analizó en forma conjunta con la variación mensual de casos de LTA diagnosticados en el Instituto de Investigaciones de Enfermedades Tropicales (IIET) durante el periodo de muestreos entomológicos de esta tesis. Así se determinó la existencia de un intervalo de tiempo de aproximadamente 90 días entre los meses de gravidez de hembras y los meses en que se registra un mayor número de casos humanos.A lo largo de esta tesis se buscó, principalmente, abordar molecularmente a los vectores potenciales de LTA que fueron capturados en sitios con riesgo de transmisión. Para esto, se normalizó y aplicó la combinación de PCR-RFLP del gen 18S ARN ribosomal (18S ARNr) para la tipificación molecular de hembras. Como resultado, las especies circulantes en los sitios de muestreo: Nyssomyia neivai, Migonemyia migonei, complejo cortelezzii y Psathyromyia shannoni pudieron ser identificadas molecularmente; siendo la combinación PCR-RFLP 18S ARNr capaz de incluso identificar ejemplares que la metodología tradicional no había podido determinar por la ruptura de estructuras de valor taxonómico o por un montaje inadecuado. Los patrones de restricción obtenidos fueron especie-específicos y fueron validados por la identificación morfológica tradicional.Por otra parte, 1.671 hembras fueron capturadas y analizadas molecularmente para la detección de ADN de Leishmania spp. Previamente, se puso a punto la PCR ADN kinetoplastídico (ADNk) para la búsqueda de material genético parasitario, con una sensibilidad de 25 promastigotes por flebótomo. Luego, esta fue combinada con PCR de Actina para que la resultante PCR dúplex ADNk-actina permita el análisis de pooles de 10 hembras. Además, para tipificar y genotipificar la especie parasitaria en flebótomos, se estandarizó la PCR del gen de proteína heat shock 70 (hsp70) y PCR de citocromo b (cyt b) con cepas de Leishmania de referencia, asilados de pacientes con LTA y aislados de perros con leishmaniosis canina previamente tipificados.Finalmente, para búsqueda tradicional de infección natural, 254 hembras fueron capturadas y diseccionadas para la observación microscópica de su contenido intestinal. Tanto las hembras analizadas por disección como aquellas analizadas molecularmente resultaron negativas para infección por Leishmania spp. lo que destaca la baja tasa de infección de los vectores de LTA y el carácter microfocal de la transmisión cuya dinámica depende principalmente de los reservorios, que se desconocen en la zona hasta el momento.