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El uso de hormigón reciclado aparece como uno de los temas de interés en el campo de la tecnología del hormigón considerando la necesidad de incorporar criterios de desarrollo sustentable en ámbito de la construcción civil. Los agregados reciclados poseen características particulares con respecto a los agregados naturales; en general se destacan su mayor porosidad y absorción, como también su menor densidad y resistencia. Existen antecedentes que indican que las características de las interfaces matriz-agregado reciclado favorecen la adherencia. Al mismo tiempo se ha demostrado que los cambios en la rigidez del hormigón con agregados reciclados son más importantes que los registrados en la resistencia a compresión. Estos hechos permiten presuponer que pueden existir cambios en el mecanismo de falla del hormigón con agregados reciclados, particularmente a medida que se elevan los niveles de resistencia. Esta tesis tiene como objetivo analizar el mecanismo de rotura bajo cargas de tracción en hormigón con agregados reciclados. En primer lugar se presenta la caracterización de los agregados gruesos naturales y reciclados a través de las medidas de densidad, absorción, desgaste y estimación de su resistencia a través de ensayos de carga puntual, y se analiza la adherencia de morteros con diferentes relaciones agua/cemento con agregados naturales (piedra partida granítica) y dos tipos de agregado reciclado obtenidos a partir de la trituración de un hormigón de resistencia normal y un hormigón de alta resistencia. Seguidamente se analizan tres series de hormigones con diferentes niveles de resistencia las cuales incluyen un hormigón de referencia elaborado con agregado natural y dos hormigones reciclados elaborados con los mismos agregados reciclados. Se evaluaron la respuesta en flexión de vigas entalladas, la resistencia a tracción por compresión diametral y el comportamiento bajo compresión uniaxial sobre cilindros normalizados. Con el fin de considerar el efecto de los agregados naturales y reciclados y de los distintos niveles de resistencia de la matriz se analizaron las superficies de fractura observando la distribución y estado de los agregados e interfaces. Los resultados permiten discutir la incidencia que poseen la adherencia de interfaces y la resistencia relativa de las fases componentes del hormigón sobre el mecanismo de rotura del compuesto.

En esta Tesis se abordó el estudio de los mecanismos bioquímicos involucrados en la interacción entre algunas bacterias promotoras del crecimiento y dos plantas de interés agronómico, arroz (Oryza sativa) y tomate (Solanum lycopersicum). La bacteria Azospirillum brasilense promovió el crecimiento de plantas de arroz, especialmente de su sistema radicular; la inoculación indujo un aumento en la producción de etileno en la planta y en la actividad y expresión de la ácido 1-amino-ciclopropano-1- carboxílico sintasa (ACS). Se observó también un aumento en la actividad de quinasa de proteínas dependiente de Ca⁺² cuyas características bioquímicas indican que se trata de una CDPK que estaría relacionada con el crecimiento de las raíces laterales. La inoculación con A. brasilense promovió el crecimiento de plantas de tomate, aumentó los niveles de ácido indol acético (AIA) y etileno y la actividad y expresión de ACS. El suplemento exógeno de etileno y el uso de un inhibidor de su percepción permiten asignar a modo de hipótesis un rol intermediario del etileno en la promoción del crecimiento del sistema radicular en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. El análisis global del perfil de expresión génica asociado a la inoculación de plantas de tomate con A. brasilense indicó que la inoculación estimuló la expresión de una variedad de genes, muchos de los cuales se inducen por etileno y que se han encontrado sobre expresados en otras especies en respuesta a la infección con patógenos o afectadas por agentes generadores de estrés. Los niveles de expresión de los genes implicados en el establecimiento de la respuesta hipersensible aparecen sub expresados lo cual podría favorecer el establecimiento de la interacción endofítica entre A. brasilense y tomate. Utilizando la técnica de 2D-DIGE se comenzó el análisis de los perfiles de proteínas expresadas en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense. Con esta técnica se logró evidenciar diferencias en los patrones de expresión que dependen del tratamiento al que se sometió a las plantas.

Durante mucho tiempo la Eritropoyetina (Epo) fue conocida únicamente por su acción sobre el sistema hematopoyético. Más recientemente, investigaciones desarrolladas para comprender los mecanismos básicos de sus efectos biológicos han revelado un efecto pleiotrópico de Epo que se extiende más allá de la regulación eritropoyética. En este sentido, su capacidad citoprotectora sugiere un posible uso terapéutico en enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares, además de su administración a pacientes anémicos. Por otro lado, la actividad de Epo sobre progenitores eritroides de médula ósea ha sido asociada a una mayor incidencia de eventos trombóticos e hipertensión en pacientes, lo cual ha dado origen a la búsqueda de compuestos derivados incapaces de estimular la eritropoyesis que conserven su actividad citoprotectora. Uno de estos compuestos es la eritropoyetina modificada por carbamilación (cEpo), cuyos efectos sobre el endotelio no han sido estudiados en profundidad hasta el momento. Con el fin de optimizar el uso clínico de Epo se requiere de un mayor conocimiento para aclarar la compleja interrelación de las acciones hematopoyética y no-hematopoyética de esta citoquina sobre distintos tejidos. En base a esto, uno de los objetivos de este trabajo de Tesis Doctoral es aportar nuevos datos sobre los efectos y mecanismos de acción de Epo sobre el endotelio, con particular interés en la angiogénesis, al mismo tiempo que se busca dilucidar si la carbamilación de la molécula de Epo introduce algún cambio en su actividad biológica sobre células endoteliales. Mediante técnicas de migración por wound healing, formación de túbulos de células endoteliales sobre un sustrato símil matriz extracelular y análisis del ciclo celular, realizados sobre la línea celular endotelial humana EA.hy926, determinamos un efecto inductor de Epo sobre la función angiogénica, que no fue observado con cEpo. En cuanto a los mecanismos de acción involucrados, hemos descrito la participación del receptor EpoR2 y de la quinasa JAK2, asociados a la acción eritropoyética de Epo, en su efecto inductor de la migración en células endoteliales. Si bien cEpo fue capaz de activar las vías de señalización asociadas a Epo, su ausencia de efecto promigratorio estaría relacionada con un cierre prematuro de su señal, mediado por la fosfatasa PTP1B. Este mecanismo de acción diferencial entre ambas eritropoyetinas fue reportado en trabajos anteriores de nuestro grupo realizados en células eritroides. Por otro lado, nuestros resultados muestran un efecto dual de Epo sobre la generación de especies reactivas de oxígeno, siendo capaz de prevenirla a tiempos largos de exposición, al igual que cEpo, pero también estimulándola en forma transiente, lo cual constituiría un mecanismo promigratorio. La enzima óxido nítrico sintasa también estaría relacionada con la acción de Epo sobre la migración de células EA.hy926. La relación entre calcio y eritropoyetina, descrita anteriormente en la diferenciación eritroide, también es importante en la migración de células endoteliales, como lo confirman ensayos realizados con quelantes de este catión. Mediante experimentos realizados con inhibidores farmacológicos de canales de calcio dependientes de voltaje se determinó la participación de los mismos en el influjo de este catión estimulado por Epo, lo que constituye una evidencia a favor de la expresión de estos canales en células endoteliales. El estudio de estos canales nos permitió, además, conocer la actividad antiangiogénica de la amlodipina, un antagonista de calcio de uso clínico como antihipertensivo. Por otra parte, también se determinó la importancia de canales de calcio TRPC y canales de potasio en la respuesta migratoria a Epo. El calcio fue también un intermediario en el efecto inductor de Epo sobre la expresión de acuaporina-1, cuya función como proteína canal de agua hemos visto por primera vez asociada a la migración estimulada por Epo. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de Tesis muestran un efecto diferencial de eritropoyetina y su derivado carbamilado sobre la angiogénesis, mediante mecanismos similares a los observados en células eritroides, y aportan información sobre los diferentes intermediarios y efectores de Epo en su modulación de la actividad angiogénica. La incapacidad de cEpo de activar procesos relacionados a la migración celular genera interés en su posible aplicación terapéutica, ya que podría ejercer citoprotección sin estimular la angiogénesis ni la eritropoyesis en pacientes donde estos procesos pueden representar un efecto indeseado.

La exposición a aluminio (Al) afecta la eritropoyesis. Sin embargo, poco se conoce acerca de las características de este efecto, así como de los mecanismos involucrados. En el presente trabajo de investigación se planteó, como primer objetivo, la necesidad de caracterizar la anemia producida por sobrecarga oral crónica con Al. Después de ocho meses de tratamiento, los animales desarrollaron anemia no ferropénica. La disminución de la concentración plasmática de haptoglobina, el aumento de reticulocitos y la presencia de esquistocitos apoyan la naturaleza hemolítica de la anemia desarrollada. A causa del tratamiento, se observó una importante inhibición del desarrollo de CFU-E en ensayos ex vivo de células de médula osea. El otro signo notable fue la aparición de severas alteraciones morfolófgicas en eritrocitos de sangre periférica, lo que sugirió una acción directa del A1 sobre las células eritroides maduras. Esa posibilidad fue corroborada en ensayos in vitro de eritrocitos humanos incubados en presencia del metal, en los cuales el rasgo persistente fue la desaparición de la típica forma bicóncava. El aumento de la degradación de la proteína estructural banda 3, observado junto con la detección de depósitos de A1 en la membrana, apoya no sólo la estrecha relación entre la morfología celular y la estructura y organización de la membrana del eritrocito, sino también una acción directa del metal sobre componentes de la membrana. La disminuida respuesta de las células progenitoras CFU-E a la eritropoyetina (Epo), después de la exposición crónica a Al, motivó la investigación de los efectos del metal sobre mecanismos involucrados en la vía de activación del receptor para Epo (EpoR). La exposición a A1 provocó disminución del EpoR a nivel de ARNm y de proteína, hallazgo que coincidió con la anulación del efecto antiapoptótico de la Epo sobre células K562. En la línea UT-7, altamente dependiente de Epo, sólo una exposición crónica a Al modificó la respuesta a la 1a hormona. Después de esa exposición, el aumento del EpoR a nivel de ARNm y de proteína, detectado bajo condiciones de carencia de Epo, sugiere un aumento de la sensibilidad de esta línea celular a1 factor de crecimiento. En conclusión, es evidente que el Al no resulta un elemento inocuo. Actúa sobre el sistema eritropoyético afectando a las células eritroides en distintos estadios de maduración. Los resultados sugieren una acción directa del metal sobre los componentes de la membrana celular de los eritrocitos maduros y un mecanismo de interferencia en distintos caminos de activación de células eritroides inmaduras mediados por la formación del complejo eritmpoyetina-receptor.

La anemia que padecen los pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC) terminal resulta de la convergencia de múltiples factores. Entre ellos, escasa síntesis de eritropoyetina (Epo), presencia de sustancias que deprimen la eritropoyesis y pérdida de sangre durante la diálisis y por el tracto gastrointestinal. La intoxicación por aluminio (Al) de pacientes que reciben medicamentos que contienen al catión puede producir, o incluso empeorar, la anemia preexistente. El propósito del presente trabajo es explorar si las sustancias acumuladas en el plasma de pacientes con IRC inhiben la eritropoyesis y establecer el grado de participación del Al en ese proceso de inhibición. Los resultados alcanzados señalan que los pacientes con IRC poseen un número adecuado de progenitores eritroides tardíos (CFU-E), células que, aisladas del entorno urémico, responden normalmente a1 estímulo por Epo. En el plasma de estos pacientes existen sustancias (PM>10 kDa) que interrumpen el desarrollo de CFU-E, pero que no modifican el PM de las proteínas de la membrana de los glóbulos rojos. La electroforesis de estas proteínas muestra perfiles similares entre los pacientes y los individuos con función renal normal (FRN). Algunos mecanismos de acción del Al pueden ser conocidos a través de las experiencias realizadas in vitro. El Al³+ es captado por las células eritroides sólo cuando está unido a transfenina (Tf), no desplaza al Fe³+ ya unido a Tf e inhibe el desarrollo de CFU-E si existen sitios de unión vacantes en la molécula de Tf. La inhibición ocurre en presencia de Epo en estadios tempranos de la estimulación celular, no es anulada por mayores concentraciones de Epo o de Ca²+ y depende del compuesto de Al. El estudio de la acción del Al sobre la eritropoyesis in vivo muestra que la sobrecarga oral con 0,5 μmol Al/g peso/día durante 2 semanas, induce la inhibición del desarrollo de CFU-E in vitro, en ratones con FRN. La sobrecarga durante 22 semanas provoca, además, la disminución del hematocrito (Hto) y de la hemoglobina (Hb), correlación negativa entre la concentración plasmática de Epo y el Hto y disminución de la fragilidad osmótica de los eritrocitos circulantes. La administración de 1 μmol Al/g peso/día durante 102 días a ratas con FRN provoca aumento de la concentración sérica de Al y moderada inhibición del desarrollo de CFU-E. Mayores dosis de Al inducen la disminución del Hto y la Hb, el aumento de la resistencia osmótica, el acortamiento de la vida media eritrocitaria y la acumulación ósea de Al. En ratas con IRC, se observa aumento de la concentración de Al en suero, cerebro y hueso, así como una marcada inhibición del desarrollo de CFU-E. En síntesis, el Al resulta tóxico para las células eritroides cuando la acumulación intracelular está favorecida. La liberación lenta desde un compartimiento profundo que lo ha acumulado (tejido óseo), puede derivar en una exposición endógena prolongada de las células eritropoyéticas en la médula ósea y favorecer la aparición de signos de anemia. Palabras claves: insuficiencia renal crónica, anemia, toxinas urémicas, eritropoyesis, inhibición de CFU-E, aluminio, toxicidad del aluminio, acumulación tisular de aluminio.

En esta tesis se estudiaron los mecanismos asociados con la exocitosis vesicular altamente acoplada al estímulo, su recuperación, y su mantenimiento frente a la aplicación de potenciales de acción a bajas frecuencias de estimulación, propias del estado basal de estas células. En primer lugar, se evidenció que frente a la aplicación de un estímulo que simula un potencial de acción se libera un grupo de ≈ 8 vesículas, al que denominamos ETAP (por exocytosis triggered by action potential). Este pool vesicular está incluido en el pool inmediatamente liberable (IRP, ≈ 25 vesículas), y su exocitosis depende en un 50% de fuentes de Ca2+ extracelulares y en un 50% de un mecanismo independiente del influjo de Ca2+. Mientras que IRP recupera lentamente (τ ≈ 7 s) luego de ser deprimido, ETAP presenta una rápida cinética de recuperación (τ ≈ 0.7 s). Esta recuperación depende de dos procesos: (i) transferencia de vesículas desde pooles vesiculares río arriba, y (ii) una endocitosis rápida dependiente de dinamina y altamente acoplada a la exocitosis precedente. En la segunda parte de esta tesis se investigó el mecanismo de exocitosis independiente del influjo Ca2+ mencionado previamente. Utilizando despolarizaciones cuadradas de 100 ms (máxima respuesta), se determinaron la siguientes características para dicho fenómeno: (i) independencia de fuentes extracelulares e intracelulares de Ca2+; (ii) dependencia de la proteína SNARE sinaptobrevina; (iii) dependencia sigmoidea con el voltaje aplicado; (iv) los resultados sugieren que el sensor de voltaje sería el canal de Ca2+ tipo P/Q, y que interaccionaría con la maquinaria exocitótica a través de la secuencia synprint. En resumen, los resultados muestran que un potencial de acción induce una exocitosis altamente acoplada y sincrónica al estímulo que es dependiente en parte de un mecanismo activado por Ca2+ y en parte de otro activado directamente por voltaje. Finalmente, demostramos que esta exocitosis, gracias a su rápida velocidad de recuperación vesicular, es capaz de mantener la secreción de manera continua a frecuencias basales fisiológicas.

Hemos demostrado que el aluminio induce colestasis asociada a múltiples alteraciones en transportadores hepatocelulares que participan en la función secretora bibliar, al igual que Mrp2. El objetivo fue investigar si estos efectos perjudiciales son mediados por el estrés oxidativo causado por el metal. A tal efecto, fue estudiada la capacidad antioxidante de la vitamina E, en ratas Wistar macho. El aluminio se administró ip (27 mg / kg de peso corporal, tres veces a la semana, 90 días). Vitamina E (600 mg / kg de peso corporal) fue coadministrado, sc. El Aluminio aumento la peroxidación lipídica (+50%) y disminuyó el glutation hepático (-43%) y la actividad del glutation peroxidasa (-50%) y catalasa (-88%). La vitamina E contrarrestó total o parcialmente estos efectos. Los niveles de Al en plasma e hígado fueron significativamente reducidos por la vitamina E (-40% y -44%, respectivamente, p <0,05). Aluminio aumentó 4 veces el índice de apoptosis hepática, y este efecto fue contrarrestado por la vitamina E. El flujo biliar se redujo en ratas con Al (-37%), y fue normalizado con la vitamina E. El antioxidante normalizó el manejo hepático de los sustratos de Mrp2, rosa de bengala y dinitrophenyl-S-glutatión, relacionados con la restauración de su expresión. Esto indica que el estrés oxidativo juega un papel crucial en la colestasis, apoptosis o necrosis hepatocelular ocacionada por el Aluminio, y que la vitamina E previene estos efectos nocivos impidiendo la formación de radicales y favoreciendo la eliminación del metal.