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En zonas áridas y semiáridas, las estrategias evolutivas de uso del agua determinan la posibilidad de coexistencia, entre especies vegetales. El objetivo propuesto de evaluar si existen diferencias en los niveles de tolerancia a sequía entre pastos que coexisten en un sistema semiárido patagónico, y si dichas diferencias determinan su capacidad de competir por el agua y el resultado de esa competencia a largo plazo. Se estudiaron 4 especies de pastos: Bromus pictus, Poa ligularis, Pappostipa speciosa y Festuca pallescens. En dos experimentos controlados P. speciosa fue la especie más tolerante (menor efecto de la sequía sobre la biomasa), la menos plástica y la de menor crecimiento potencial. En el otro extremo, B. pictus fue la menos tolerante, más plástica y con mayor crecimiento potencial. P. ligularis junto con F. pallescens, esta última proveniente de un ambiente con mayor productividad, resultaron ser especies de plasticidad y crecimiento potencial intermedios. En un experimento de dos años de duración en el campo, la especie menos tolerante (B. pictus)mostró menor habilidad competitiva que la más tolerante (P. speciosa)solamente cuando la disponobilidad de agua era baja y su competidora era de mayor tamaño. Mediante modelos de Markov, basados en mapas sucesivos de vegetación, de parcelas permamentes clausuradas al pastoreo, se observó para una ventana temporal de 7 años que la especie más representada en la comunidad climáxica no era ni la más tolerante ni la de mayor crecimiento potencial. Las especies mostraron diferencias claras de dinámica: la menos frecuente (B. pictus)persiste gracias a su permanencia en cada sitio ocupado; la más frecuente (P. ligularis), en cambio, mediante una elevada movilidad (colonizando suelo desnudo y reemplazando a vecinas), mientras que P. speciosa, de frecuencia intermedia, presentó una combinación entre permanencia y movilidad. Estos pastos mostraron diferencias funcionales en el uso del agua, señalando al gremio de los pastos perennes patagónicos como un grupo más heterogéneo de lo que pensaba. Las diferencias en el uso del agua implicarían una diferenciación funcional de los nichos de las especies posibilitando su coexistencia.

La producción de las nanopartículas de plata (AgNP) se encuentra en continuo aumento, al mismo tiempo que los cuerpos de agua se convirtieron en los principales sumideros de estas sustancias emergentes. El objetivo general de esta tesis fue comprender los mecanismos de toxicidad de las tgNP en organismos acuáticos. Para ello se realizaron ensayos con diferentes modelos biológicos (peces dulceacuícolas, moluscos marinos) y tipos de ensayos (in vivo, branquias ex vivo). Las AgNP pudieron ingresar en los tejidos de los organismos y acumularse en ellos de manera dosis y tiempo dependiente. En los peces se registraron diferentes efectos tóxicos, tales como disminución de la cantidad de bacterias que viven en el mucus epidérmico, generación de estrés oxidativo en varios tejidos, alteraciones en parámetros hematológicos e inmunológicos y movilización de reservas energéticas. En moluscos, además, se produjo desestabilización de la membrana de los hemocitos, inducción de metalotioneínas, genotoxicidad y daño en los transportadores de membrana. Por otra parte, se demostró que los efectos tóxicos producidos por AgNP pueden ser atenuados cuando las sustancias húmicas están presentes en el medio. En conjunto, esta tesis brinda una visión integradora sobre los principales mecanismos de toxicidad de las AgNP en organismos acuáticos. Asimismo, la información generada es de suma relevancia a la hora de tomar medidas de control y regulación para asegurar la protección del medio ambiente y la sustentabilidad de la industria nanotecnológica.

Los ritmos biológicos diarios son el resultado de la interacción entre un reloj circadiano endógeno y factores ambientales sincronizadores, principalmente la luz, que ejerce su efecto a través de cambios en la fase de los ritmos controlados. El objetivo del presente trabajo de tesis fue caracterizar la vía (o una de las vías) de transducción de señales fóticas que ponen en hora al reloj circadiano de mamíferos. Para ello, se realizaron técnicas de registro comportamental (medición de actividad locomotora), neuroquímico (actividad de neurotransmisores), bioquímico (actividad enzimática, cuantificación proteica, fosforilación, etc.) y molecular (western blot, hibridación in situ) en hámsters (Mesocricetus auratus), obteniendo tejido hipotalámico conteniendo los núcleos supraquiasmáticos, sede del reloj circadiano. Los resultados de esta tesis, junto con las evidencias de la bibliografía sobre el tema, permiten sugerir un modelo de señalización de cuya entrada es la interacción del glutamato de la vía retinohipotalámica con receptores de tipo NMDA, que inducen un aumento en el influjo de calcio. A su vez, este ion es capaz de activar tanto a la proteína quinasa dependiente de Ca2+ y calmodulina (CaMKII) y a la óxido nítrico sintetasa (NOS). El óxido nítrico, y posiblemente también el monóxido de carbono, otro mensajero gaseoso, producen un aumento en la actividad de la guanilil ciclasa soluble (GC), que promueve una subida en los niveles del GMPc y la activación de la proteína quinasa G (PKG). Si bien son pocos conocidos los sustratos de esta en el cerebro, se aportan evidencias en favor de que esta vía de señales lleva a la expresión fótica de genes reloj como mPer2.

En este trabajo se estudiaron los mecanismos de transporte a través del epitelio intestinal, la cinética de acumulación y los efectos tóxicos producidos por la cianotoxina microcistina-LR (MCLR), en dos especies de peces patagónicos de importancia económica y ecológica: el pejerrey patagónico (Odontesthes hatcheri) y la trucha arco-iris (Oncorhynchus mykiss), potencialmente expuestos a floraciones de cianobacterias y a sus metabolitos tóxicos. Se evaluó la capacidad de O. hatcheri de digerir cianobacterias y absorber MCLR a través de la administración de células de Microcystis aeruginosa tóxicas (productoras de MCLR) mezcladas con alimento comercial. En este experimento un grupo de peces recibió células de M. aeruginosa previamente rotas por métodos fisicoquímicos (MCLR libre) y otro grupo recibió las células intactas. En los dos casos, O. hatcheri acumuló MCLR en intestino e hígado, en igual proporción entre tratamientos, demostrando que esta especie es capaz de digerir la pared de las cianobacterias y de absorber la MCLR liberada en el tracto digestivo. En un segundo experimento se determinaron los efectos tóxicos provocados por la absorción de MCLR en O. hatcheri. Un tratamiento consistió en administrar células rotas de M. aeruginosa tóxica mezcladas con el alimento comercial; otro grupo de peces recibió alimento comercial mezclado con células rotas de una cepa no tóxica de M. aeruginosa (control de los efectos provocados por otros componentes de las cianobacterias); y el grupo control recibió solamente alimento comercial. La concentración de MCLR administrada de esta forma representó una concentración subletal. Luego de una única alimentación, se estudió en hígado e intestino a lo largo del tiempo: actividad de la enzima proteína fosfatasa 1 (PP1), respuestas de estrés oxidativo (actividad de enzimas catalasa, CAT y glutatión-Stransferasa, GST) y daño oxidativo (peroxidación lipídica). Se determinó la acumulación de MCLR extraíble en metanol (fracción de MCLR acumulada en su forma nativa o conjugada con GSH, o cisteína) y como MCLR unida a proteínas. La fracción extraíble en metanol se cuantificó por ensayo de inhibición de PP1 in vitro (PPIA) y por oxidación de Lemieux-cromatografía gaseosa/espectrometría de masas (CG/EM). La fracción unida a proteínas se cuantificó por oxidación de Lemieux-CG/EM. Los resultados obtenidos indican que MCLR se acumula tanto en intestino como en hígado, mayormente unida a proteínas. La cantidad de toxina acumulada en ambos órganos disminuye a lo largo del tiempo hasta ser prácticamente indetectable a las 48 horas post-intoxicación. En cuanto a los efectos tóxicos, sólo el hígado presentó alteraciones leves. De estos resultados se desprende que O. hatcheri es una especie que puede ser afectada por floraciones de cianobacterias tóxicas aunque esta especie sería capaz de metabolizar y eliminar la toxina acumulada, al menos a concentraciones subletales. Se estudió la participación de proteínas de membrana Abcc (Mrp) (mediadoras de la defensa celular frente a xenobióticos junto con otras proteínas de la superfamilia ABC) en el transporte de MCLR a través del epitelio intestinal. Para esto, se incubaron preparaciones ex vivo de intestino de O. hatcheri y O. mykiss con sustratos específicos de las proteínas Abcc (DNP-SG y calceína) junto con MCLR y se determinaron las tasas específicas de transporte de cada sustrato en presencia de la toxina. Se compararon los resultados obtenidos con MCLR con los efectos provocados por MK571, inhibidor específico de transportadores Abcc. Por otro lado, se evaluaron los efectos tóxicos (actividad PP1, PP2A y GST, concentración de glutatión reducido) producidos por MCLR en segmentos de intestino incubados solamente con MCLR o en conjunto con MK571. Los resultados de estos experimentos indican que los enterocitos de O. mykiss y O. hatcheri son capaces de eliminar la MCLR acumulada hacia el lado luminal (detoxificación) o hacia el lado basolateral (absorción), a través de proteínas tipo Abcc de ubicación apical y basolateral, respectivamente. El intestino de O. hatcheri sería más resistente a la toxina en comparación con el de O. mykiss debido a que en intestino de O. hatcheri no se observó ningún efecto tóxico aún a concentraciones de MCLR más altas que las aplicadas en intestino de O. mykiss. Tampoco se observaron efectos tóxicos al bloquear el transporte por proteínas tipo Abcc con MK571. Por el contrario, en intestino de O. mykiss se observó inhibición de PP1 y 2A (efecto característico de MCLR) en las concentraciones altas de MCLR o a concentraciones bajas pero en presencia de MK571. La causa de la mayor resistencia observada en O. hatcheri aún no está clara y requiere de más estudios. También se evaluaron los efectos de MCLR sobre la composición de glicoconjugados en el tracto intestinal de O. hatcheri. Este estudio se realizó aplicando técnicas de lectina-histoquímica con detección por fluorescencia. Las lectinas utilizadas fueron concanavalina-A, aglutinina de Dolichos biflorus y aglutinina de germen de trigo. Los resultados indican que MCLR afecta la abundancia y distribución de los glicoconjugados marcados, según la sección intestinal que se estudie. Estas alteraciones podrían traer consecuencias a nivel de la digestión y/o en las defensas inmunes frente a patógenos y/o podrían ser evidencia de una respuesta defensiva frente a MCLR. Por último, se aplicaron técnicas de inmunohistoquímica para localizar proteínas ABC en el intestino de O. hatcheri. Utilizando los anticuerpos para transportadores ABC de mamíferos (antiABCB1, ABCC2, ABCC4 y ABCG2) se logró marcar Abcc4 en la membrana basolateral, aunque la marca con este anticuerpo es mucho más fuerte en músculo y Abcg2 se marcó en la región subapical de los enterocitos. No hubo cambios en la localización de la marca de ninguno de estos anticuerpos en respuesta al tratamiento con MCLR.

La enfermedad de Gaucher (EG) es una patología genética de almacenamiento lisosomal, de herencia autosómica recesiva, causada por la deficiencia de la enzima lisosomal beta-glucosidasa (GCasa). Esta deficiencia lleva a la acumulación de glucosilceramida, principalmente en macrófagos. Las manifestaciones clínicas principales son: anemia, trombopenia, hepatoesplenomegalia, fracturas óseas, dolores óseos, osteopenia, osteonecrosis. Si bien el daño óseo es una característica común de la EG, los mecanismos de la injuria y destrucción tisular son desconocidos. Por otro lado se sabe que la inflamación es un factor clave en la patogénesis de la EG. En el presente trabajo de tesis se propuso profundizar en los mecanismos celulares y moleculares que llevan al daño óseo en la EG. Para el estudio de estos mecanismos se emplearon muestras de pacientes con EG y dos modelos in vitro, uno humano y uno murino, en los cuales la actividad de la GCasa es inhibida mediante el uso de un epóxido, el CBE, que inhibe irreversiblemente la enzima. En el presente trabajo se pudo demostrar la participación de los osteoclastos en el daño óseo tanto en el caso de los modelos como también en los pacientes. Por otro lado se demostró que los linfocitos T estarían involucrados en el proceso de diferenciación y activación de los osteclastos en la enfermedad. Pudo observarse también que la citoquina TNF-a sería uno de los principales mediadores involucrados en el aumento del proceso de resorción que llevaría al daño óseo en la enfermedad.

La leptina presenta un papel importante en la reproducción, principalmente se ha sugerido que presenta funciones importantes en la placenta durante la gestación, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. En mujeres embarazadas el nivel de leptina en suero aumenta en comparación a las no embarazadas, principalmente durante el segundo y tercer trimestre; aún antes de que se incremente el tejido adiposo.Originalmente la leptina, proteína de 16 kDa codificada por el gen LEP, fue descripta como una molécula producida por el tejido adiposo involucrada en la regulación del metabolismo al nivel central. La leptina placentaria podría tener efectos sobre el crecimiento, la angiogénesis y la inmunomodulación afectando tanto funciones maternas como fetales. En este trabajo, se analizó el efecto del 17β-estradiol (E2) y las vías de señalización y factores de transcripción involucrados, sobre la expresión de la leptina en la placenta humana utilizando dos modelos experimentales, la línea celular BeWo, derivada de coriocarcinoma, y explantos de placentas normales humanas a término.Al analizar la importancia del factor de transcripción Sp1 sobre la regulación de la expresión de leptina mediada por estradiol, pudimos demostrar que la sobreexpresión de este factor incrementa la expresión de leptina determinada por Western blot. Más aún la sobreexpresión de un vector de expresión para Sp1 incrementa tanto la actividad basal del promotor de leptina como la inducida por E2. Específicamente aumenta la actividad de la región del promotor de leptina comprendida entre -1951 y -1887pb que contiene al ?enhancer? placentario de leptina (PLE). Estos resultados fueron confirmados al utilizar un inhibidor de Sp1, el ácido betulínico. En estos experimentos se pierde el efecto inductor de Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria. La acción ejercida por este factor de transcripción sobre la expresión de leptina es dependiente de ERα ya que en las células que expresan un siRNA contra este receptor la sobreexpresión de Sp1 no tiene efecto alguno sobre la expresión de leptina. Además al utilizar un vector reportero que contiene el sitio halfERE mutado, la acción de Sp1 parecería anularse. Por otro lado al utilizar un vector que presenta el promotor de leptina con el sitio de unión para Sp1 mutado, la sobreexpresión de ERα no es capaz de inducir la expresión de leptina. Estos resultados sugieren que es necesario que se encuentre intacto el sitio de Sp1 para que se pueda evidenciar el efecto de ERα sobre la expresión de leptina placentaria.Además se evalúo la posible interacción de ERα y Sp1 por inmunoprecipitación. Se demostró que hay interacción entre ambas proteínas, ya que al inmunoprecipitar ERα, se puede evidenciar la presencia de Sp1 en el inmunoprecipitado, y al inmunoprecipitar Sp1 se puede observar ERα en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que habría un efecto cooperativo entre ambos factores en la inducción de la expresión de la leptina placentaria.El antagonista estrogénico, ICI 182,780 no generó inhibición alguna sobre el efecto del Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria, lo que sugeriría que la inducción de Sp1 sobre la expresión de leptina no estaría siendo afectada por el inhibidor ICI 182,780.Encontramos también que la expresión basal e inducida por E2 se ve disminuida con el tratamiento con el inhibidor del factor NFκB, sulfasalazina, sugiriendo la participación de los dímeros del NFκB en los efectos regulatorios de dicho esteroide. A través de transfecciones transitorias hemos observado que la sobreexpresión de la subunidad p65 (Rel-A) aumenta la actividad transcripcional basal del promotor de leptina y por otro lado la sobreexpresión de Rel-A en las células BeWo-Sh2, que poseen los niveles de ERα disminuidos por la estrategia de siRNA, produce una marcada disminución de la actividad basal del promotor de leptina, sugiriendo que el efecto de la sobreexpresión de p65 sobre el nivel basal de actividad del reportero sería dependiente de la expresión de ERα ya que al disminuir los niveles de este receptor el efecto de p65 se suprime. Por otro lado la sobreexpresión de p65 no estaría afectando la expresión de leptina mediada por E2 en presencia o ausencia de ERα.Se ha evaluado también la presencia y localización de ERα y la subunidad p65 en las células BeWo, por ensayo de inmunofluorescencia y su posible interacción por coinmunoprecipitación. Hemos encontrado que ambas proteínas se encuentran localizadas en el citoplasma y cuando son sobreexpresadas migran al núcleo. Por otro lado determinamos que en las células BeWo estos dos factores de transcripción estarían interactuando, ya que al inmunoprecipitar ERα, se pudo observar p65 en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que existiría un efecto cooperativo entre el ERα y el NFκB.Hemos observado que el incremento de la expresión de leptina por estradiol en células BeWo depende de la integridad de la vía de señalización mediada por PKA, debido a que tratando a las células con inhibidores de ésta vía, H89 y SQ22536 se produce una disminución de su efecto. También observamos que la sobreexpresión de mutantes dominantes negativas para el factor de transcripción CREB anulan el efecto de estradiol sobre la expresión de leptina placentaria. Por otro lado la sobreexpresión de CBP, produce una estimulación del efecto inductor de estradiol, mientras que la sobreexpresión con HDAC, una deacetilasa de histonas, genera el efecto contrario. El tratamiento con tricostatina A (TSA), un inhibidor de la actividad acetiltransferasa, contrarresta el efecto de HDAC-1. Esto indicaría que la regulación de la expresión de leptina por estradiol sería un proceso multifactorial que involucraría la activación de la vía de señalización de PKA y la modificación de la acetilación de histonas.Los resultados obtenidos contribuyen a mejorar la compresión de la expresión de leptina en la placenta humana así como las vías de señalización y factores de transcripción que actúan en la acción del E2 sobre la expresión de la misma.

Cardozo, A. J. (2015). Mecanismos moleculares involucrados en la diferenciación neuronal de células madre mesenquimales humanas derivadas de tejido adiposo (Tesis de Doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

La familia de las leguminosas incluye a varios de los cultivos más importantes del mundo. Sus miembros pueden generar otros meristemas de novo en sus raíces, llamados nódulos, a partir de la interacción simbiótica con las bacterias del suelo. Los nódulos simbióticos les permiten a las plantas fijar nitrógeno atmosférico y crecer en suelos poco fértiles. Por este motivo, las leguminosas son consideradas como los cultivos pioneros para la incorporación de suelos salinos en la agricultura. Además, su presencia estimula el crecimiento de otras especies de plantas. Sin embargo, tanto el crecimiento como la arquitectura de las raíces, incluyendo la formación de los nódulos, son muy sensibles a las limitaciones del ambiente, como la disponibilidad de agua y el estrés salino, condiciones que se reflejan en el detrimento de la productividad. En este trabajo de tesis caracterizamos dos factores de transcripción involucrados en el desarrollo de raíces y nódulos de la planta modelo de leguminosas Medicago truncatula. El primero, MtHB1, regula una respuesta adaptativa del desarrollo con el fin de minimizar la superficie de contacto de las raíces con el medio estresante. El otro, MtRR1, participa en la regulación de la formación de los nodúlos mediada por las fitohormonas citoquininas.

La formación placentaria normal influencia el desarrollo embrionario a término. Alteraciones en factores que regulan la interacción materno-fetal temprana, tales como la disrupción de los niveles de óxido nítrico (NO), las metaloproteasas (MMPs) y desbalances en el estado oxidativo, son causa de placentopatía y anomalías embrionarias tempranas. Con la hipótesis que la exposición materna a alcohol desde antes de la preñez (17 días previos a la preñez) y hasta la organogénesis (día 10 de gestación (D10) genera cambios en la expresión y actividad de MMPs y de moléculas de la matriz extracelular, afecta la regulación del sistema nitridérgico, incrementa las especies reactivas del oxígeno en la interfase trofoblásticodecidual y en el embrión, y conduce a anomalías de la placentación temprana y disrupción del desarrollo embrionario durante la organogénesis, se plantearon los siguientes objetivos, luego de la administración perigestacional de 10% de alcohol a hembras murinas: 1) determinar los efectos materno en variables biométricas y reproductivas; 2) en el embrión: a) analizar la morfogénesis embrionaria, la calidad histológica y la adhesión celular, b) evaluar la expresión de moléculas de la MEC y MMPs, c) evaluar la expresión y actividad de las óxido nítrico sintasas (NOS), d) analizar los cambios en el sistema oxidativo y sus consecuencias en macromoléculas embrionarias. 3) En el tejido trofoblástico-decidual (T-D): a) analizar cambios histológicos y nucleares; b) evaluar la expresión de colágenos, proteoglicanos, ácido hialurónico y MMPs; c) analizar las alteraciones en el sistema nitridérgico; d) determinar el estado oxidativo y efectos lipídicos, proteicos y nucleares. La ingesta perigestacional de alcohol induce, al D10, pérdida de los sitios de implantación, aumento de las reabsorciones, retraso del desarrollo embrionario, disminución del crecimiento y anomalías morfológicas e histológicas embrionarias por disrupción de la expresión de cadherinas y de MMPs, colágenos y proteoglicanos, efectos posiblemente relacionados con alteraciones del sistema nitridérgico, aumento de estrés oxidativo y efectos nitrosativos y apoptóticos. El tejido trofoblástico y decidual de las hembras tratadas presentó cambios en la morfología nuclear, alteraciones del lecho vascular, disminución de los colágenos fibrilares en la MEC y alteraciones en la expresión y actividad de MMP-2. El sistema nitridérgico también fue afectado por la exposición a alcohol, evidenciado por alta concentración de nitritos, aumento de estrés oxidativo y lipoperoxidación. En conclusión, el daño histomorfológico embrio-placentario temprano por exposición perigestacional a alcohol, vinculado a alteraciones en las moléculas de la MEC, podrían ser producto, al menos en parte, de desbalances en la producción de agentes moduladores como las especies reactivas de oxígeno y el óxido nítrico en la interfase materno-embrionaria temprana.

Las células pueden detectar, generar y responder a un amplio rango de señales externas, químicas y físicas, integrar y analizar esta información y, en consecuencia, cambiar su morfología, dinámica, comportamiento y, eventualmente, destino. A nivel celular, las respuestas biológicas a fuerzas externas se originan en dos tipos de estructuras especializadas: adhesiones focales (célula-matriz extracelular) y uniones adherentes (célula-célula). Las adhesiones focales son complejos de proteínas dispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular, a través de receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Estos sitios de adhesión son estructuras planas, alargadas de unos pocos micrones cuadrados que a menudo están localizadas en la periferia de las células, y que además funcionarían como organelas de señalización en el proceso de mecanotransducción celular. Uno de los retos que se presenta para estudiar el sistema es el de poder integrar y combinar distintas técnicas que nos permitan analizar la dinámica intracelular, la biomecánica de la célula/sustrato, detección de las fuerzas generadas en/por la célula, y observar la respuesta global de la célula en las distintas condiciones. Entonces, el estudio de la estructura, mecánica y dinámica de las proteínas de adhesiones focales en respuesta a un estímulo mecánico en células vivas requiere de técnicas que permitan visualizar y caracterizar en forma integrada la dinámica de eventos localizados en la célula. Estos métodos deben contar con una resolución espacio-temporal alta, de forma tal que permitan detectar eventos transientes y altamente localizados. En este contexto, se han implementado, en este trabajo de Tesis, distintas microscopías y espectroscopías de alta resolución espacial y temporal, en combinación con técnicas de biología molecular y celular. Con el objetivo de caracterizar las propiedades mecánicas de sustratos y células, en una primera etapa se implementó un modo de operación avanzado en microscopía de fuerza atómica (AFM), denominado PF-QNM (del inglés, Peak Force Quantitative Nanomechanical Property Mapping). Este modo permite obtener simultáneamente la imagen de topografía, junto con los mapas cuantitativos sobre las propiedades de elasticidad, adhesión, dureza, disipación de energía y deformación superficial. Se utilizaron sistemas modelo con distintas propiedades mecánicas de manera tal de cubrir el amplio rango que va desde GPa a kPa, y estudiar las propiedades de sustratos (vidrio, membranas de silicona y geles de poliacrilamina), así también como la línea celular utilizada en la Tesis. A nivel de adhesión focal, la estrategia fue transfectar células de epitelio mamario de ratón (HC11), con proteínas componentes de la adhesión (por ejemplo, zixina, FAK, vinculina, paxilina) fusionadas a proteínas fluorescentes visibles. De esta forma, empleando microscopías y espectroscopías de fluorescencia, es posible visualizar la expresión de las proteínas, registrar su localización y evolución en el tiempo y, mediante diferentes análisis, extraer información cuantitativa de dinámica, cinética y organización de los complejos de adhesión focal. El análisis de la dinámica y difusión de los complejos de adhesión focal y sus interacciones, fueron realizados mediante la espectroscopía por correlación de fluorescencia (FCS). Se caracterizaron los coeficientes efectivos de difusión de las proteínas mencionadas. El análisis de la correlación cruzada de las fluctuaciones de fluorescencia de pares de proteínas de adhesión focal (FCCS) permitió evidenciar la interacción entre distintas proteínas adhesivas de la adhesión focal. La cinética de disociación de proteínas desde la adhesión focal fue evaluada mediante la recuperación de la fluorescencia luego del fotoblanqueo (FRAP) en diferentes condiciones. Para estudiar los cambios generados en la organización y dinámica de adhesiones focales en células vivas en respuesta a un estímulo mecánico externo global, se empleó un dispositivo de tracción equibiaxial adaptado para ser usado en simultáneo con el microscopio confocal FV1000. La tensión mecánica aplicada por el dispositivo de tracción es capaz de inducir cambios en el área de las células vivas al igual que en las adhesiones focales. En respuesta al estiramiento mecánico se observó un mayor reclutamiento y translocación de la proteína zixina acompañado de una disminución significativa de su constante de disociación. Con el fin de correlacionar las propiedades mecánicas del sustrato y la fuerza de tracción generada por la célula a nivel de las adhesiones focales, sin perder de vista la organización y dinámica de las proteínas en la adhesión focal, se implementó la Microscopía de Fuerzas de Tracción (TFM). Esta técnica posee la sensibilidad necesaria para medir la fuerza de tracción generada por la célula sobre un sustrato elástico y transparente, la cual se puede combinar con otras técnicas de microscopía de fluorescencia como FRAP o FCS. El análisis de los datos TFM para la proteína zixina permitió obtener los mapas de deformación y de fuerzas de tracción, a la vez que se evaluó la cinética de disociación mediante FRAP.