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La toxina alfa hemolisina (HlyA) es un importante factor de virulencia producido por cepas uropatogénicas de Escherichia coli. Su expresión se correlaciona con una mayor severidad de las infecciones producidas por estas cepas con mayor prevalencia de daño renal y bacteriemia. HlyA es secretada por la bacteria en una conformación soluble en medio acuoso e interacciona con la membrana plasmática de la célula blanco produciendo poros proteolipídicos que conducen a la lisis celular. Este proceso es complejo y altamente dependiente de las características físicas de la membrana. El objetivo de este trabajo de tesis fue profundizar en el conocimiento del mecanismo de acción de HlyA, específicamente en la interacción de HlyA con la membrana y con los lípidos de membrana.

El objetivo general de este trabajo es contribuir a la determinación de la constitución, la topografía, y las transformaciones de los lípidos en el núcleo celular. Es, además, determinar los mecanismos de acción en los que los lípidos están involucrados que conducen, entre otros, a la regulación de la expresión genética. Se propusieron los siguientes objetivos específicos: 1- Determinar la constitución y la localización de los pooles lipídicos nucleares de células de hígado de rata normal. 2- Determinar los posibles mecanismos por los cuales los ácidos grasos procedentes del citosol se internalizan, interaccionan y redistribuyen en los pooles lipídicos del núcleo celular. 3- Determinar el rol de L-FABP en la internalización, interacción y redistribución de los AG en los pooles lipídicos del núcleo celular. Con esos objetivos se plantearon las siguientes hipótesis: • Los pooles lipídicos nucleares y endonucleares están constituídos mayoritariamente por fosfolípidos y por un alto porcentaje de AG polinosaturados. • Los AG llegan al interior nuclear como AGL o como acilCoAs e interaccionan con los pooles lipídicos nucleares y endonucleares por un mecanismo acil-CoA dependiente. • La L-FABP favorece de manera específica la interacción de los AG con los pooles lipídicos nucleares y endonucleares.

La producción de granos en soja depende, al menos en parte, del fotoperíodo explorado durante post-floración. Este efecto fotoperiódico ha sido vinculado a los cambios en la duración de la oferta de recursos (efecto indirecto) ya que el fotoperíodo modifica la duración de la etapa post-floración. Sin embargo, los cambios en el fotoperíodo también alteran la morfología y el desarrollo de las plantas de soja pudiendo afectar directamente la producción de granos, además de los cambios mencionados en la oferta de recursos. Este tipo de efectos fotoperiódicos directos permitirían hacer un uso más eficiente de los recursos para producir granos. En este marco, el objetivo de esta tesis es estudiar los mecanismos asociados a la producción de granos en soja frente a cambios en el fotoperíodo en post-floración. Se realizaron dos experimentos a campo con tratamientos de extensión artificial del fotoperíodo para identificar los mecanismos fotoperiódicos involucrados en la producción de granos a nivel de cultivo y a nivel de nudo, en un genotipo comercial de soja. A su vez, se incluyeron tratamientos de sombreo (distintos niveles de radiación incidente) para discriminar cuáles de dichos mecanismos fotoperiódicos están mediados por cambios en la oferta de radiación (indirectos) y cuáles son efectos del fotoperíodo per se (directos). Además, se realizaron otros dos experimentos utilizando líneas casiisogénicas y genotipos comerciales con distinta sensibilidad fotoperiódica para analizar la variabilidad genotípica para los mecanismos fotoperiódicos involucrados en la producción de granos. La extensión del fotoperíodo aumentó la producción de granos a nivel de cultivo a través de cambios en la oferta de recursos (efectos indirectos). Sin embargo, también se observaron efectos directos del fotoperíodo sobre la producción de granos mediante la modificación de la producción de nudos. La extensión del fotoperíodo distribuyó espacialmente los destinos, lo cual permitiría hacer un uso más eficiente de los recursos al reducir la nterferencia entre vainas que crecen en un mismo nudo. Asimismo, se encontró variabilidad genotípica para este mecanismo fotoperiódico directo. A nivel de nudo, la extensión del fotoperíodo retrasó el inicio de la elongación de vainas dominantes y permitió que se extendiese la floración, abriesen más flores y estableciesen más vainas en posiciones normalmente dominadas del nudo. Este efecto fotoperiódico también distendió la interferencia entre vainas que crecen en un mismo nudo a través cambios en la distribución temporal de los destinos. Sin embargo, no se encontró variabilidad genotípica para este mecanismo fotoperiódico bajo condiciones de fotoperíodo natural. Los resultados obtenidos revelan mecanismos asociados a la producción de granos en soja frente a cambios en el fotoperíodo en post-floración que son independientes del aumento de la oferta de recursos. Dichos mecanismos involucran efectos fotoperiódicos directos sobre las relaciones intra-nodales entre vainas, mediados por el efecto del fotoperíodo sobre la producción de nudos y la tasa de desarrollo de las vainas.

El transporte intracelular de proteínas es una actividad esencial para las células eucariotas. La vía secretora ejecuta el transporte de proteínas hacia el exterior celular y participa en el transporte de proteínas y lípidos entre los diferentes compartimentos de membrana que integran la vía. La coordinación de las distintas etapas de transporte entre los compartimentos intracelulares es necesaria para permitir el flujo de membranas y mantener el tamaño de las organelas y la homeostasis celular.Las proteínas que son transportadas a través de la vía secretora son traslocadas al Retículo Endoplásmico (RE) y, posteriormente, son reclutadas a regiones especializadas del mismo, denominadas sitios de salida del RE (ERES - ?ER Exite Sites?). En estos sitios, el complejo proteico de cubierta tipo II (COPII) es el responsable de concentrar y seleccionar el material a ser exportado, y también participa en la deformación de la membrana necesaria para la generación de intermediarios de transporte. Luego, en la interfase de los ERES y el compartimiento intermedio entre RE y Golgi (ERGIC o VTCs) se produce el intercambio de COPII por el complejo de cubierta tipo I (COPI), que permite el transporte hacia el complejo de Golgi (anterógrado) o de vuelta al RE (retrógrado). La GTPasa Rab1 es primordial para el transporte anterógrado de proteínas y lípidos desde el Retículo Endoplásmico (RE) al complejo de Golgi, donde interacciona con múltiples efectores que integran la vía secretora. Rab1b participa en el reclutamiento del complejo COPI y la consiguiente maduración de los VTCs. En este trabajo se demostró que Rab1b interacciona con los componentes de COPII Sec23, Sec24 y Sec31, y que la inhibición de Rab1b modifica el fenotipo de COPII. Además, se observó que Rab1b modula la dinámica de asociación/disociación de COPII a membranas en la interfase de los ERES. Nuestros resultados sugieren que Rab1b es un regulador clave de la función y dinámica de asociación/disociación de COPII.Las vías de transporte intracelular de membranas son ubicuas, pero están diferencialmente desarrolladas en los diversos tejidos dependiendo de su función. Los órganos secretores deben adaptarse a la necesidad creciente de secreción de proteínas que ocurre durante el desarrollo, diferenciación, o cambio de las condiciones fisiológicas. Si bien la maquinaria de transporte que participa en la vía secretora ha sido ampliamente descripta, poco se conoce sobre la regulación de la capacidad secretora en células especializadas. Empleando como modelo secretor y respondedor a un estímulo específico la línea celular derivada de tiroides de rata Fischer, FRTL-5, se demostró que el estímulo con TSH promueve el incremento de los niveles de factores de transporte y del volumen del Golgi. Estos cambios ocurren de manera simultánea con la producción de proteínas importantes en la función tiroidea (cargo), sugiriendo que el incremento resultante en la maquinaria de transporte no es consecuencia del incremento de cargo. Además, se encontró que gran cantidad de factores de transporte poseen en su región regulatoria un motivo altamente enriquecido, el cual presenta alta homología con la secuencia descripta para el elemento respondedor a AMPc (CRE). Concordantemente, los cambios observados en los factores de transporte son mediados por la vía de la adenilato ciclasa/AMPc. Finalmente se observó que TSH induce la activación y el incremento de los niveles del factor de transcripción CREB3L1, quien promueve el incremento del volumen del complejo de Golgi, incluso en células no estimuladas. En conjunto estos datos indican que, se desencadena una respuesta celular global que le permite a la célula adaptarse al incremento de cargo, sugiriendo que vías de señalamiento comunes modulan la producción de genes específicos de tiroides y de la maquinaria de transporte.

En el presente trabajo se evaluó la capacidad antiproliferativa, anticolesterogénica y los efectos sobre el metabolismo lipídico de dos isoprenoides de 10 carbonos, linalool (monoterpeno alcohol lineal) y 1,8-cineole (monoterpeno cíclico con grupo éter), sobre células HepG2 (procedentes de un hepatocarcinoma humano) como modelo de célula hepática y A549 (provenientes de adenocarcinoma de pulmón humano) como tipo celular extra-hepático. Se analizaron los mecanismos de acción involucrados y los efectos del tratamiento combinado de ambos monoterpenos entre sí o de cada monoterpeno con simvastatina (una estatina modelo) evaluando los posibles efectos sinérgicos de cada interacción. La actividad de los isoprenoides naturales sobre la colesterogénesis y proliferación celular se concentra en la vía del mevalonato (VM), una vía metabólica muy compleja indispensable para la homeostasis celular. Esto se debe a que la VM no solo es la vía de síntesis del colesterol, sino que además provee intermediarios fundamentales para la prenilación de proteínas de la superfamilia Ras, proteínas reguladoras de la proliferación y supervivencia celular. Durante el desarrollo de este trabajo se determinó la viabilidad y proliferación celular por los métodos de MTT, rojo neutro y recuento celular. En todos los casos, tanto los monoterpenos como la simvastatina inhibieron la proliferación celular, mientras que las combinaciones de a pares entre monoterpenos y cada uno de ellos con simvastatina mostraron un efecto sinérgico en dicha inhibición. Se estudió la distribución de las poblaciones en el ciclo celular, apoptosis por diferentes metodologías y la localización subcelular de Ras, a diferentes concentraciones. Tanto linalool como 1,8-cineole arrestaron el ciclo celular, principalmente en G0/G1 mientras que linalool también indujo apoptosis en células HepG2. Al combinar los compuestos se observó en gran parte de los casos una interacción sinérgica sobre la inducción de apoptosis. Linalool disminuyó los niveles de Ras en membrana plasmática y los aumentó en citosol, mientras que al combinase con simvastatina, la inhibición de la traslocación a membrana fue levemente potenciada. A través de experimentos de incorporación de 14C-acetato en lípidos en condiciones donde la proliferación no se encuentra afectada, se demostró que linalool y 1,8-cineole inhibieron la VM, probablemente a diferentes niveles. Esto resultó en una reducción de la colesterogénesis y una acumulación de intermediarios y/u otros productos finales de la vía. Las concentraciones efectivas en la inhibición de la síntesis de colesterol fueron considerablemente inferiores a las necesarias para ejercer efecto antiproliferativo, sobre todo para 1,8-cineole. En ciertos casos, los tratamientos aumentaron la incorporación de colesterol exógeno. Ambos monoterpenos afectaron la incorporación de acetato en lípidos neutros, fosfolípidos y ácidos grasos, cada uno de manera diferente. La combinación de ambos isoprenoides entre sí, o de cada uno con simvastatina, inhibió sinérgicamente la síntesis de colesterol. A bajas concentraciones linalool y 1,8-cineole bloquearon etapas específicas de la colesterogénesis mientras que a concentraciones elevadas provocaron una inhibición de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGCR), enzima limitante de la velocidad de la VM. El agregado de mevalonato exógeno fue incapaz de revertir la inhibición de la proliferación promovida por ambos compuestos, lo que demuestra que la inhibición de HMGCR por sí sola no es responsable de tal efecto y refuerza la hipótesis de la inhibición a nivel de la prenilación de proteínas como principal mecanismo antiproliferativo. Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis contribuyen a un mejor entendimiento de la acción de linalool y 1,8-cineole sobre la VM aportando conocimiento sobre los posibles mecanismos involucrados en su actividad anticolesterogénica y antiproliferativa. También sugieren el potencial uso de estos compuestos como una alternativa natural para ser utilizados en terapias contra cáncer y/o enfermedades cardiovasculares, ya sea solos, combinados entre sí o con estatinas.

La hormona paratiroidea (PTH) es un importante mediador de la remodelación ósea y actúa junto al calcitriol (1α,25(OH)2vitamina D3), como regulador esencial de la homeostasis del calcio y fósforo. El péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) es una poli hormona que tiene un papel importante en el desarrollo del feto y en la homeostasis de tejidos adultos actuando principalmente en forma parácrina. Puede ser expresada y secretada por varios tumores y es responsable de la hipercalcemia humoral maligna, siendo éste un signo de mal pronóstico en las neoplasias malignas. Al momento de comenzar este Trabajo de Tesis había poca información acerca del rol de PTHrP actuando como factor parácrino sobre células derivadas del cáncer colorrectal (CCR). En el presente Trabajo se evidencia que PTHrP es capaz de inducir un aumento en la proliferación celular de dos líneas celulares derivadas de CCR, las células Caco-2 y las células HCT116. Además, este efecto inducido por la hormona está modulado por las cascadas de señalización PKC, Src, Akt, ERK MAPK y β-catenina. Se observó que en las células tumorales intestinales la hormona mediante ERK MAPK desencadena el aumento de la expresión y/o activación por fosforilación de CREB/ATF-1, c-myc y ciclina D1, que son moléculas relevantes en la proliferación celular. Acorde con lo observado in vitro, los experimentos desarrollados en el modelo murino revelan que la administración continua de la hormona en forma intra-tumoral modula la expresión de los marcadores claves en la progresión del CCR ERK, ciclina D1 y CREB/ATF-1. Tanto las células tumorales intestinales normales como aquellas que sobre-expresan PTHrP responden a la acción de las hormonas calciotrópicas PTH y calcitriol, al menos a nivel transcripcional, disminuyendo la expresión de PTHrP. PTHrP no sólo favorece la activación de vías mitogénicas y la proliferación de las células Caco-2 y HCT116 sino que también es capaz de disminuir la sensibilidad de estas células al Irinotecán (que es una droga comúnmente utilizada para la quimioterapia del CCR) mediante las vías de ERK MAPK y β-catenina.Este trabajo aporta información original respecto al rol del análogo tumoral de PTH en células tumorales intestinales y los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta hormonal de estas células tanto in vitro como in vivo. Además, profundiza el conocimiento respecto de los mecanismos moleculares modulados por las hormonas calciotrópicas PTH y calcitriol en células tumorales intestinales. Un aporte de este Trabajo de Tesis es que al elucidar las vías de señalización que regulan los procesos inducidos por PTHrP y que favorecen la proliferación y/o quimiorresistencia, se podrían generar estrategias terapéuticas alternativas en el tratamiento del CCR cuya finalidad es inhibir la expresión de PTHrP o su mecanismo de acción en estas células tumorales.

Tesis (Dra. en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019

Tesis (Doctor en Ciencias Agropecuarias)--UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2011.

La glicosilación de proteínas es la modificación postraduccional más abundante en las células. La biosíntesis de glicanos, a diferencia de la síntesis de ADN, se lleva a cabo de manera independiente de un templado. Los mecanismos que controlan y resguardan la fidelidad de los glicanos aún son poco conocidos. El objetivo general de esta tesis es contribuir al conocimiento de los mecanismos de regulación de glicosiltransferasas que inician la biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc. La glicosilación de tipo O-GalNAc es iniciada por la familia de polipeptidil N-acetilgalactosaminil transferasas (ppGalNAc-Ts) constituída por 20 miembros, los cuales incorporan un residuo de N-acetilgalactosamina sobre residuos serina/treonina (αGalNAc-Ser/Thr) de un polipéptido aceptor. Estas glicosiltransferasas son proteínas de membrana tipo II que presentan en su porción luminal un dominio catalítico y en el extremo carboxilo terminal un dominio tipo lectina con un plegamiento característico de tipo β-trefoil. Uno de los objetivos específicos de esta tesis fue estudiar la influencia de estos dominios tipo lectina en la actividad enzimática de glicosiltransferasas que inician la glicosilación de tipo O-GalNAc. En primer lugar, se demostró que los dominios lectina de ppGalNAc-T3 y T4 (T3lec y T4lec) inhiben la actividad enzimática de las isoformas ppGalNAc-T2 y T3. Este efecto inhibitorio pudo ser corroborado in vivo utilizando la línea celular CHO ldlD. Los resultados mostraron que se trata de una interacción proteína-proteína en donde el dominio lectina de una ppGalNAc-T interacciona con el dominio catalítico de otra isoforma. A su vez, tanto T3lec como la enzima ppGalNAc-T3 (incluyendo el dominio catalítico y lectina) fueron capaces de activar la actividad de C1GalT, enzima que cataliza la incorporación de galactosa sobre αGalNAc-Ser/Thr. Esto pone de manifiesto el rol regulatorio diferencial de los dominios lectina sobre enzimas que catalizan reacciones consecutivas en esta biosíntesis de glicanos.Por otro lado, la acetilación de lisinas está emergiendo como un mecanismo de control postraduccional cada vez más frecuente que puede ocurrir en todos los compartimentos subcelulares. Múltiples glicosiltransferasas residentes en Golgi se han informado como enzimas blanco de la acetilación entre ellas las isoformas ppGalNAc-T2 y T9. Por eso, la segunda parte de esta tesis está abocada a estudiar el efecto de la acetilación de lisinas sobre las propiedades biológicas de las ppGalNAc-Ts. En particular, se focalizó en el efecto de una mutación puntual que simula acetilación en la K626 localizada en un motivo estructural conservado (QKW) del dominio lectina de ppGalNAc-T3. Esta mutación (K626Q) disminuyó la actividad catalítica de la enzima y su capacidad de interacción con glicanos de tipo O-GalNAc. En ensayos de interacción con el glicopéptido (MUC1-αGalNAc) y péptidos derivados de mucinas, la mutante incrementó su unión a los mismos en presencia de glicósidos de GlcNAc.En conclusión, ambos mecanismos de regulación estudiados en la presente tesis muestran al plegamiento β-trefoil de los dominios lectinas de ppGalNAc-Ts como estructura clave para la regulación de la glicosilación de tipo O-GalNAc dadas sus propiedades de interacción con múltiples moléculas.

La herbivoría es una de las principales amenazas para las plantas teniendo impactos negativos no solo en los sistemas naturales sino también en los agro-ecosistemas. De la coevolución con los insectos han surgido en las plantas numerosas estrategias para sortear las amenazas como barreras físicas y bioquímicas. Además, muchas plantas establecen relaciones simbióticas con microorganismos, como los hongos micorrízicos, rizobacterias y hongos endofitos, los cuales inducen los mecanismos de defensa de las plantas, o aportan mecanismos adicionales de defensa como los alcaloides producidos por los hongos endofitos en pastos. Para el caso en particular de la simbiosis pasto-endofito, no existen trabajos que exploren la posibilidad de que ambos mecanismos (los alcaloides fúngicos y los cambios inducidos por el simbionte sobre los mecanismos de resistencia de la planta) funcionen de forma conjunta frente al ataque de insectos. En esta tesis buscamos comprender la interacción entre los mecanismos de resistencia conferidos por la simbiosis con los endofitos y el sistema inmune de la planta frente al ataque de insectos herbívoros. Para ello, avanzamos en un modelo teórico que incorpora conjuntamente el impacto potencial de los endofitos sobre los mecanismos de defensa de las plantas, específicamente el de las homonas ácido salicílico y ácido jasmónico, y los compuestos tóxicos sintetizados por el hongo (i.e. alcaloides). La validación del modelo propuesto es abordada a través de dos aproximaciones. Primero, una síntesis y análisis cuantitativo de la información existente en la literatura. Segundo, las hipótesis del modelo serán puestas a prueba a través de experimentos manipulativos del estado de la simbiosis y de las hormonas, complementado con la evaluación del crecimiento y/o desarrollo de distintas especies de insectos herbívoros. Combinando experimentos fácticos con herramientas de la química ecológica, este proyecto constituye el primer esfuerzo en integrar el mecanismo de resistencia conferido por los hongos endofitos con los mecanismos de defensa de las plantas.