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Manual of Techniques in Invertebrate Pathology, Second Edition, describes a wide range of techniques used in the identification, isolation, propagation/cultivation, bioassay, quantification, preservation, and storage of the major groups of entomopathogens, including entomophthorales, entomopathogenic fungi, entomopathogenic bacteria of the Bacilli, Nematode parasites, and pathogens and parasites of terrestrial molluscs. The book presents the perspectives of an international group of experts in the fields of invertebrate pathology, including microbiology, mycology, virology, nematology, biological control, and integrated pest management.
Organized into 15 chapters, the book covers methods for the study of virtually every major group of entomopathogen, as well as methods for discovery and diagnosis of entomopathogens and the use of complementary methods for microscopy. It discusses the use of molecular techniques for identifying and determining phylogeny, factors that contribute to resistance to entomopathogens, and several other aspects of the science of invertebrate pathology. It also explains initial handling and diagnosis of diseased invertebrates, basic techniques in insect virology, and bioassay of bacterial entomopathogens against insect larvae. In addition, the reader is introduced to the use of bacteria against soil-inhabiting insects and preservation of entomopathogenic fungal cultures. The remaining chapters focus on research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists, how the pathogenicity and infectivity of entomopathogens to mammals are tested, and preparations of entomopathogens and diseased specimens for more detailed study using microscopy.
Experienced insect pathologists, biologists, entomologists, students, biotechnology personnel, technicians, those working in the biopesticide industry, and government regulators will find this manual extremely helpful.

• Step-by-step instructions for the latest techniques on how to isolate, identify, culture, bioassay and store the major groups of entomopathogens
• New edition fully updated to address changes in the taxonomy of the vast majority of taxa
• Discussion of safety testing of entomopathogens in mammals and also broader methods such as microscopy and molecular techniques
• Provides extensive supplemental literature and recipes for media, fixatives and stains

En maíz, bajo condiciones de alta productividad, tanto la estructura como la supervivencia del canopeo determinan el máximo aprovechamiento de la radiación incidente durante el crecimiento del cultivo. Determinados caracteres, como el número y tamaño de las hojas, su ángulo de inserción en el tallo y la altura de planta condicionan la penetración y distribución de la luz a través de los estratos foliares y así afectan la eficiencia con la cual es interceptada, mientras que el retardo en la senescencia permite prolongar la producción de fotoasimilados para el llenado de los granos. El uso de estos atributos como rasgos secundarios en la selección de genotipos mejorados para esos ambientes puede aumentar la eficiencia del proceso y el aprovechamiento de la variabilidad genética asociada a estos rasgos en conjunto con el mapeo de QTLs permitiría entender las bases genéticas que los controlan y mejorar por selección la eficiencia de la captación de luz en maíz. El objetivo de este trabajo fue estudiar las bases genéticas que controlan la variabilidad de los caracteres ecofisiológicos asociados con la captación de radiación solar en una población de líneas endocriadas recombinantes de maíz mediante la identificación de QTLs asociados a los mismos. Como material vegetal se utilizó una población de 151 RILs obtenida a partir del cruzamiento entre las líneas parentales LP179 y L5605, las cuales difieren significativamente en los valores medios de los caracteres asociados a la captura de luz. Se realizaron tres ensayos de evaluación fenotípica durante las campañas 2013/2014, 2014/2015 y 2015/2016. Se determinó la presencia de variabilidad genotípica y el efecto de la interacción genotipo x ambiente para cada uno de los caracteres evaluados y se estimaron las heredabilidades en sentido estricto en base a medias de familias endocriadas. Para la evaluación genotípica se utilizaron marcadores moleculares SSR que previamente resultaron polimórficos entre las líneas parentales. Se construyó un mapa de ligamiento genético con los SSR que presentaron segregaciones esperadas 1:1 para la población de RILs. Mediante los programas Win QTL Cartographer V 2.5 y QTL Network 2.0 se efectuó la búsqueda de QTLs siguiendo los métodos de mapeo por Intervalo Compuesto, mapeo por Intervalo Compuesto mediante un modelo lineal mixto y mapeo de caracteres múltiples. En la población de RILs existió variabilidad genotípica significativa para todos los caracteres evaluados y el efecto de la interacción genotipo x ambiente fue significativo, indicando un comportamiento diferencial de los genotipos ante los cambios de ambientes. Se obtuvieron valores de heredabilidad elevados para todos los rasgos (mayores a 0,5), indicando una importante contribución de la variabilidad genotípica a la variación fenotípica de los caracteres. VI Con los marcadores que segregaron de acuerdo a las frecuencias esperadas se construyó un mapa de ligamiento, mediante el cual se obtuvo una cobertura de 1319,9 cM y una distancia promedio entre SSR de 12,8 cM. Mediante el análisis de correlaciones y de sendero se determinó que el IAF fue el atributo asociado a la arquitectura de canopeo que mayor relevancia tuvo en la generación de biomasa y rendimiento. Sin embargo no sería conveniente emplearlo en un esquema de selección indirecta para mejorar el rendimiento, sino incorporarlo como característica secundaria en un índice de selección. La evaluación de una población de mapeo generada a partir de germoplasma local y genéticamente distante de las poblaciones reportadas en la literatura aportó nueva información acerca de la arquitectura genética que controla a los caracteres asociados con captura de luz. Los diferentes métodos de mapeo empleados permitieron identificar varias regiones genómicas, algunas de las cuales coinciden con otras previamente reportadas en trabajos previos, y nuevas regiones que no habían sido identificadas. Algunos QTLs con estabilidad en su expresión a través de ambientes, podrían elegirse en un esquema de selección asistida por marcadores orientado a aumentar la producción de biomasa y el rendimiento potencial en ambientes locales, a través del mejoramiento de los rasgos que determinan la eficiencia en la captura de luz, que se encuentran bajo un control genético complejo, compuesto por QTLs de efecto mayor en conjunto con QTLs de efecto menor.

Tesis para obtener el grado de académico de Magister en Genética Vegetal, de la Universidad Nacional de Rosario, en 2018

El Mal de Río Cuarto (MRC) es la enfermedad viral más importante del maíz (Zea mays L.) en Argentina. El uso de genotipos resistentes es el medio más económico, ambientalmente sostenible y efectivo para controlar enfermedades en cultivos extensivos. El objetivo de este trabajo fue identificar regiones genómicas asociadas con la resistencia a la enfermedad MRC en un grupo de líneas de maíz de CIMMYT. Una revisión sistemática y un meta-análisis se realizaron con el propósito de identificar cromosomas que portan QTL de efecto mayor para resistencia a enfermedades virales en maíz. La evaluación fenotípica de 291 líneas de maíz se realizó en cuatro localidades de la provincia de Córdoba, Argentina durante 2015/16, 2016/17 y 2017/18. La combinación año-localidad definió nueve ambientes. A partir de los síntomas observados se estimaron los caracteres severidad (SEV), incidencia (INC) e índice de severidad de la enfermedad (ISE) MRC. Las medias ajustadas de las líneas de maíz en cada uno de tres ambientes y la mejor predicción lineal insesgada (BLUP) a través de éstos se estimaron mediante modelos lineales mixtos. A partir de la caracterización genotípica disponible públicamente de las líneas de maíz, se seleccionaron 45.925 SNPs. El análisis de estructura genética poblacional indicó la presencia de tres subgrupos definidos en base a la adaptación ambiental de las líneas de maíz. El análisis del desequilibrio de ligamiento (DL) mostró una rápida caída (10-20 kb; r2<0,10) que brindó la posibilidad de alcanzar una alta resolución de mapeo. El análisis de mapeo por asociación se realizó para los tres ambientes que permitieron diferenciar a los genotipos. Este permitió identificar 54 marcadores SNPs, en 46 regiones genómicas, asociados significativamente con la resistencia a la enfermedad MRC. La variación fenotípica explicada por estos QTL osciló entre 6% y 24%, con un valor medio de 10%. Veintitrés de estos marcadores se encuentran en regiones donde previamente se reportaron grupos de genes y QTL para resistencia a enfermedades virales en maíz. El análisis de regresión lineal múltiple con los marcadores significativos en la asociación permitió identificar 2, 3, 4 y 5 SNPs que explicaron entre 21% y 44% de la variación fenotípica, según carácter y ambiente. Estos SNPs resultan promisorios para la selección de líneas de maíz de CIMMYT con alelos favorables para la resistencia a la enfermedad MRC.

El mapeo por asociación es una herramienta poderosa que permite la identificación de loci cuya contribución explica parte de la variación fenotípica observada. En general, los marcadores utilizados en estos estudios son los Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNPs, Single Nucleotide Polymorphisms) y los indels (eventos de inserción, insertion/deletion). Los objetivos de este trabajo comprendieron el estudio de la diversidad nucleotídica y el alcance del desequilibrio de ligamiento (DL) en girasol cultivado, y el diseño de una estrategia de mapeo por asociación para la resistencia a la Podredumbre Húmeda del Capítulo (PHC), causada por Sclerotinia sclerotiorum. La frecuencia de SNPs (1/61) y la diversidad nucleotídica (θ=0,0067) se determinaron sobre un panel de 31 genes y 19 líneas endocriadas de girasol. La frecuencia de SNPs en conjunto con un alcance del DL hasta 100 kb (r2~0,1) permitieron diseñar un estudio de asociación a través de la estrategia de genotipificación de genes candidatos. Un total de 30 genes candidatos fueron seleccionados a partir de: (1) el análisis de los perfiles transcripcionales de un genotipo de Brassica napus resistente a S. sclerotiorum, (2) una colección de transcriptos de expresión diferencial de una línea de girasol moderadamente resistente desafiada con S. sclerotiorum y (3) genes descriptos en literatura como partícipes en los procesos de defensa frente a PHC. La elección, caracterización y genotipificación de genes candidatos implicó la generación de herramientas para la selección de los mismos y la optimización de técnicas de genotipificación de SNPs a gran escala. La detección de moléculas heterodúplex mediante: (1) corte con la enzima endonucleasa CEL1 (CEL1CH) y (2) cromatografía líquida de alto rendimiento en condiciones de desnaturalización parcial (dHPLC), demostraron ser técnicas robustas y versátiles para aumentar el número de loci e individuos a incluir en los estudios de mapeo por asociación. Un total de 16 genes se genotipificaron exitosamente en la población de mapeo por asociación constituida por 134 accesos del Banco Activo de Girasol de la Estación Experimental Agropecuaria (EEA) INTA Manfredi. El análisis estadístico de asociación incluyó el uso de modelos lineales mixtos que corrigieron los problemas de estructuración y las relaciones de parentesco entre los individuos de la población de mapeo. Un alelo del gen RhoBP_B exhibió una asociación estadísticamente significativa con una menor incidencia de PHC (pp<0,05). Los resultados obtenidos demuestran que es posible encontrar alelos útiles implicados en caracteres complejos a través de los estudios de mapeo por asociación en girasol.