Catálogo de publicaciones

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal- IMBIV-CONICET-Universidad Nacional de Córdoba-2015 - 128 h. con Apéndices + CD. tabls.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicación Derivada de la Tesis. Abstract en español e inglés.

Las células somáticas pueden ser reprogramadas a células pluripotentes denominadas Células Madre Pluripotentes Inducidas (CMPi) y éstas, a su vez, pueden diferenciarse a cualquier tipo celular adulto. Esto es de gran importancia en los campos de la medicina regenerativa, las pruebas farmacológicas in vitro y la investigación de trastornos genéticos, dado que pueden obtenerse células pluripotentes sin enfrentar la barrera ética de la manipulación de embriones y con el valor agregado de ser genéticamente idénticas al donante de células somáticas. Por lo tanto, el estudio del proceso de reprogramación se ha vuelto cada vez más importante para mejorar los métodos en eficiencia, rapidez y seguridad. Teniendo en cuenta su interacción con factores de transcripción implicados en el estado pluripotente de la célula, los factores inducibles por hipoxia, HIF por su sigla en inglés, podrían ser de interés en el proceso de reprogramación. En el presente trabajo hemos aislado distintos tipos de células somáticas humanas, como fibroblastos, queratinocitos y células mononucleares de sangre periférica, los hemos cultivado, y hemos intentado reprogramarlos. Además estudiamos distintas condiciones de generación de CMPi, utilizando distintos vectores necesarios para la reprogramación, moléculas que modifican la estructura de la cromatina como Ácido Valproico y Butirato de Sodio, y diferentes protocolos, hasta llegar a un método confiable y reproducible. A partir de ello, hemos generado CMPi en condiciones de normoxia e hipoxia, y posteriormente las hemos cultivado a largo plazo también en ambas condiciones. Hemos validado la legitimidad bona fide de las líneas celulares generadas, evaluando la expresión de genes marcadores de estado indiferenciado y por otra parte, la pluripotencia, mediante protocolos de diferenciación in vitro, e in vivo, por formación de teratomas. Asimismo, encontramos que ambas líneas exhiben características morfológicas y proliferativas, y patrones de metilación del ADN propios de células madre pluripotentes. Estudiamos además el comportamiento de las líneas celulares en cultivo en cuanto a eficiencia de reprogramación, expresión de factores del estado pluripotente, proliferación y apoptosis. Encontramos que la hipoxia aumentó la cantidad de colonias generadas pero éstas resultaron más pequeñas en tamaño, en comparación con las colonias generadas en normoxia. Además, fue menor la expresión de marcadores del estado pluripotente en colonias de CMPi evaluadas en estadios tempranos luego de ser establecidas en hipoxia, que en las colonias generadas en normoxia. Esta expresión no aumentó cuando las colonias fueron establecidas y cultivadas a largo plazo, y luego expuestas a hipoxia aguda, pero se indujo después de una hipoxia crónica. Por otro lado, encontramos una mayor tasa de proliferación celular en CMPi cultivadas en hipoxia sin diferencias en los niveles de apoptosis. Finalmente, a fin de sentar las bases para la continuación del proyecto, generamos vectores retrovirales para poder introducir los genes de los factores HIF-1α y HIF-2α en células a reprogramar, junto con los vectores de reprogramación. Los factores HIF clonados en los plásmidos retrovirales fueron wild type y también formas mutadas que le confieren a las proteínas HIF una mayor estabilidad, y en algunos casos también una mayor capacidad de activación de la transcripción. En último lugar, investigamos el efecto de los vectores generados, en células somáticas plausibles de ser reprogramadas, y encontramos un posible efecto tóxico, probablemente debido a la acumulación de altas cantidades de proteína HIF en la célula, o de una actividad transcripcional de los genes blanco tan alta que conlleva muerte celular. Dado que la expresión del gen introducido por el vector retroviral se puede controlar debido a que utilizamos un sistema modulable Tet-Off, encontramos que un tratamiento con el agente represor disminuye la muerte celular, y podría ser necesario a la hora de co-transducir con estos vectores y los vectores de reprogramación. Esperamos que los resultados y las herramientas generadas en este trabajo contribuyan a la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la reprogramación y al desarrollo de protocolos para la generación de CMPi de alta calidad y con alta eficiencia. PALABRAS CLAVE células madre, células madre embrionarias humanas, células madre pluripotentes inducidas, hipoxia celular, reprogramación nuclear, pluripotencia, estado pluripotente, diferenciación

Existen dos zonas neurogénicas en el cerebro adulto. Una es la zona subventricular que da origen a interneuronas del bulbo olfatorio y otra es la zona subgranular del giro dentado del hipocampo que genera células granulares (CGs). Las CGs nacidas en animales jóvenes se desarrollan y maduran por varias semanas, durante las cuales establecen conexiones funcionales aferentes y eferentes, adquiriendo la capacidad de procesar información. Para estudiar de qué manera este proceso es alterado por la edad se marcaron células progenitoras neurales (CPNs) de ratones de distintas edades con la proteína fluorescente verde y se analizó su morfología a distintos tiempos post-inyección, obteniéndose así las curvas de maduración para neuronas nacidas en en distintos momentos. A partir de este análisis se pudo observar que a medida que avanza la edad, la tasa de maduración se ralentiza, notándose un mayor efecto en las primeras semanas del desarrollo de estas neuronas. A medida que el ratón envejece presenta niveles decrecientes de actividad basal del giro dentado que correlaciona con un desarrollo neuronal más lento. A pesar de dicho retraso, experimentos de electrofisiología demostraron que estas neuronas son capaces de integrar un estímulo excitatorio y disparar potenciales de acción de modo comparable a la de neuronas nacidas en el animal adulto joven. Para comprender las bases del efecto del envejecimiento en el desarrollo neuronal se plantearon diversas manipulaciones experimentales para modular su tasa de maduración. En primer lugar se sometió a los ratones envejecidos a ejercicio voluntario y se observó que este tratamiento aceleró la maduración neuronal en animales envejecidos, con efectos más dramáticos en animales más viejos. Los niveles del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) se encuentran disminuidos en hipocampos de animales envejecidos, y los hipocampos de ratones corredores presentan mayores niveles de BDNF comparados con los sedentarios, indicando un posible efecto de este factor neurotrófico en el desarrollo neuronal de ratones envejecidos que realizan ejercicio físico. Para determinar si un efecto de aceleración de la maduración puede estar relacionado con la propia actividad eléctrica de las neuronas en desarrollo, se utilizó la transducción retroviral de receptores sintéticos acoplados a proteína G para activarlas en forma intrínseca. Esta manipulación también revirtió el efecto provocado por el envejecimiento. Para investigar el rol del BDNF en el desarrollo neuronal de animales envejecidos se utilizó la técnica de ARN de interferencia (short hairpin ARN) para Lrig1, un modulador negativo de la vía de BDNF. Se observó un aumento en el efecto dendritogénico en las CGs que sobreexpresan el shLrig1 en animales envejecidos. Esto sugiere un rol clave de la vía del BDNF en el desarrollo neuronal. Estos resultados demuestran que tanto la actividad del nicho neurogénico como la propia actividad de la célula cumplen un rol crucial en la tasa de maduración de las CGs. Palabras claves: Envejecimiento, neurogénesis adulta, desarrollo neuronal, plasticidad neuronal, ejercicio voluntario, actividad neuronal, BDNF.

La expansión de la frontera agrícola ha involucrado un notable incremento en el uso de biocidas en la Argentina. En este trabajo nos propusimos evaluar los impactos del glifosato (N-fosfonometilglicina, PMG) sobre dos especies no blanco: Cnesterodon decemmaculatus y Odontesthes bonariensis. Los resultados obtenidos indicarían que el PMG (en su forma ácida y grado analítico) no presenta un nivel significativo de toxicidad letal aguda (CL50-96h > 100 mg.L-1) para C. decemmaculatus. Sin embargo, la toxicidad de un formulado de PMG resultó notablemente mayor (CL50-96h = 29 mg.L-1). Al evaluar efectos subletales en esta especie, la exposición aguda a PMG provocó un aumento en la actividad de catalasa (defensas antioxidantes) e inhibición de la actividad de acetilcolinesterasa (biomarcador de neurotoxicidad). Por otra parte, la exposición crónica al formulado produjo una disminución significativa en la Carga Energética de Adenilatos (CEA) en hígado y músculo de O. bonariensis, manifestando efectos a nivel del metabolismo energético. Las branquias de estos animales, examinadas por MEB, mostraron alteraciones en su ultraestructura. Por último, se estudió el efecto de la exposición al formulado sobre la motilidad espermática y el desarrollo embrionario y larval de O. bonariensis, estableciéndose un aumento de la mortalidad de las larvas. Los resultados de este trabajo constituyen una contribución a los estudios sobre los efectos del glifosato en peces de agua dulce, así como a la evaluación y desarrollo de biomarcadores de estrés ambiental.

El hongo Macrophomina phaseolina es el agente causal de la podredumbre carbonosa de la base del tallo, una patología muy relevante en soja.. El glifosato es el herbicida más utilizado en la historia de la agricultura.. Existen antecedentes que demuestran que el glifosato reduce las defensas de las plantas.. Los fosfitos (Phi) son sales derivadas del ácido fosforoso combinadas con diferentes cationes.. Son activadores de las defensas en las plantas y tienen un efecto antifúngico directo, especialmente en Oomycetes.. El presente proyecto cumplió con los objetivos de: 1) evaluar el impacto in vitro del glifosato, Phi Mn y su combinación, sobre el crecimiento y formación de microesclerocios de M. phaseolina; 2) estudiar el efecto de las aplicaciones de estos tratamientos sobre la severidad de la podredumbre carbonosa en soja y, 3) cuantificar los cambios producidos in vivo en la respuesta de las defensas de la soja a este patógeno frente a dichos tratamientos.. El Phi de Mn presentó la menor CI50 (321 ppm), y el glifosato + Phi Mn generó una notable pérdida de coloración en los microesclerocios.. También se determinó que la mezcla de glifosato + Phi Mn redujo en un 30 por ciento la severidad de la enfermedad.. Además, el tratamiento M. phaseolina + glifosato + Phi Mn mostró un aumento significativo de la expresión de las enzimas antioxidantes y de defensa. Se concluyó que los efectos asociativos del glifosato y el Phi Mn fueron significativos, tanto en su efecto in vitro sobre los microesclerocios, como en la reducción de la severidad de la enfermedad, y en la inducción de las enzimas antioxidantes y de defensa en plantas de soja RR.. Este es el primer estudio realizado sobre el Phi Mn, el glifosato, la mezcla de ambos y sus efectos sobre la podredumbre carbonosa en soja RR.

En numerosos bosques neotropicales, el sotobosque está habitado por densas colonias de bromeliáceas terrestres. En algunas especies de bromeliáceas, las bases foliares forman un tanque donde se acumula agua y materia orgánica (fitotelma) y crecen numerosas especies de invertebrados acuáticos. Estos invertebrados forman ensambles cuya estructura depende de las condiciones ambientales del tanque y de la disponibilidad de agua y nutrientes en el mismo. Este sistema es afectado por el tamaño de la planta y las condiciones del hábitat donde vive. Esto es particularmente importante cuando la bromeliácea presenta elevada plasticidad fenotípica, ya que el hábitat puede además afectar el fitotelma al modificar la arquitectura de la planta. En el sotobosque de los quebrachales de Schinopsis balansae Engl. del Chaco Húmedo crece Aechmea distichantha Lem., que presenta una elevada plasticidad fenotípica y un fitotelma desarrollado. Para evaluar los efectos de las variaciones de las condiciones del hábitat sobre la estructura de los ensambles de invertebrados acuáticos que habitan en el tanque de esta bromeliácea se realizaron tres estudios (dos relevamientos y un experimento). En el primer relevamiento (interanual) realizado en un quebrachal del norte de Santa Fe se evaluaron los efectos del tamaño de la planta y de las condiciones dadas por diferentes hábitats dentro del bosque (hábitats abiertos, de borde y cerrado) en 30 plantas en cuatro años: (total: 120 plantas). En el segundo relevamiento se evaluaron los efectos del tamaño de la planta y de hábitats contrastantes (hábitats abiertos y cerrados) en seis quebrachales (20 plantas/sitio) ubicados a lo largo de un gradiente latitudinal en el Chaco Húmedo argentino (total: 120 plantas). En ambos relevamientos se caracterizaron las condiciones del tanque y del hábitat, se procesaron las plantas y se extrajeron e identificaron los invertebrados que habitaban en el fitotelma. En el estudio experimental, se evaluó el efecto del régimen de precipitaciones sobre la estructura de los ensambles de invertebrados del fitotelma en un quebrachal del norte de Santa Fe. Se utilizó información histórica sobre las precipitaciones de los últimos 30 años para crear diferentes escenarios en función de la cantidad total de agua y su distribución. Se seleccionaron 30 plantas y se asignó una planta a cada una de las combinaciones. Sobre cada planta se instaló un refugio para evitar el ingreso del agua de lluvia. Durante 2 meses, las plantas fueron regadas. Al finalizar, se procesaron las plantas y invertebrados. Los datos de los tres estudios se analizaron con modelos lineales generalizados y análisis multivariado. En los dos relevamientos (interanual y latitudinal) las plantas del sotobosque tuvieron mayor altura, diámetro, materia orgánica, pero menor número de hojas y volumen máximo de agua que las plantas de áreas abiertas. En el relevamiento interanual, las plantas de borde presentaron características intermedias para todas las variables. En el relevamiento interanual se registraron 3506 individuos de 30 morfoespecies pertenecientes a dos Clases: Insecta (órdenes Coleoptera, Diptera y Hemiptera) y Gastropoda (orden Pulmonata). Los detritívoros fueron el grupo trófico más diverso y más abundante en los cuatro años. Una especie detritívora (Scirtidae: Coleoptera) comprendió el 61% del total de los individuos y fue muy abundante en todos los ambientes. En los cuatro años se registró un aumento de la abundancia y la riqueza de invertebrados en función del tamaño de la planta en los tres ambientes. Hubo un efecto importante del año sobre la abundancia, riqueza, diversidad y composición específica de la comunidad, mientras que el hábitat tuvo un efecto sobre la abundancia en determinados años y fue mayor en hábitats abiertos. El año más seco tuvo una menor abundancia, riqueza y diversidad y una composición específica diferente que el año más húmedo. En el relevamiento latitudinal se registraron 9579 individuos de 30 morfoespecies pertenecientes a tres Clases: Insecta (órdenes Coleoptera, Diptera), Gastropoda (orden Pulmonata) e Hirudinea. A lo largo del gradiente latitudinal se registró un patrón común de aumento de la abundancia y la riqueza en función del tamaño de la planta. Las plantas del norte tuvieron mayor tamaño y mayor abundancia de invertebrados que las plantas del sur. Las plantas ubicadas en el sotobosque tuvieron mayor abundancia y riqueza de invertebrados que las ubicadas en las abras. Este efecto del hábitat fue menor hacia el norte. En el experimento de escenarios de precipitaciones se registraron 1195 individuos pertenecientes a 13 morfoespecies de dos clases: Insecta (órdenes Coleoptera, Diptera y Trichoptera) e Hirudinea. Se registró un efecto de la media de las precipitaciones sobre la abundancia y la riqueza de la comunidad de invertebrados del fitotelma. No hubo efectos de la distribución de las precipitaciones sobre los caracteres de la comunidad. La diversidad y la riqueza disminuyeron en los tratamientos con precipitaciones distribuidas más y menos uniformemente. Los resultados de los relevamientos interanual y latitudinal, así como del experimento de escenarios de precipitación sugieren que la heterogeneidad del hábitat juega un rol importante en la estructuración de los ensambles de invertebrados que habitan el fitotelma de A. distichantha al generar condiciones diferenciales en la disponibilidad de recursos.

El herbicida atrazina es uno de los principales plaguicidas aplicados de manera intensiva a nivel mundial. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de atrazina sobre la reproducción y su control endocrino en crustáceos decápodos. Para esto, se realizaron ensayos in vivo con hembras del cangrejo Neohelice granulata, que fueron expuestas de manera crónica a tres concentraciones subletales (0,05; 0,5 y 5 mg/L) de una formulación comercial o bien de una formulación experimental de atrazina, durante tres meses. Se observó un descenso en el contenido total de proteínas vitelogénicas en el ovario, un menor tamaño de oocitos pre-vitelogénicos y vitelogénicos, y un descenso en la proporción de oocitos vitelogénicos en los animales expuestos a 5 mg/L del formulado comercial, evidenciando un retraso en el crecimiento ovárico. Estos resultados no fueron observados en las hembras expuestas a la formulación experimental, revelando una toxicidad diferencial entre ambos formulados. Además, se observó un descenso en el contenido de glucógeno y proteínas en el músculo de las hembras expuestas a 5 mg/L, posiblemente como respuesta compensatoria al efecto estresante inespecífico del herbicida. Por otro lado, en animales ablacionados de ambos pedúnculos oculares y expuestos a 5 mg/L del formulado comercial, no se observaron cambios en ninguna de las mismas variables medidas en las hembras intactas, indicando que el retraso en el crecimiento ovárico podría deberse a una interferencia del herbicida con la regulación del proceso de vitelogénesis dada por neurohormonas pedunculares. Este mecanismo de acción del herbicida se corroboró mediante ensayos in vitro, incubando ovarios con pedúnculos oculares en presencia o ausencia de atrazina; el análisis histológico del ovario evidenció que el formulado comercial estaría actuando como un desorganizador endocrino, posiblemente estimulando la secreción desde los pedúnculos oculares de la neurohormona inhibidora del desarrollo gonadal, afectando así negativamente el crecimiento ovárico. Varios de los resultados obtenidos en N. granulata fueron también observados en la langosta Procambarus clarkii. En particular, se observó un descenso en la expresión relativa de vitelogenina (Vg) ovárica y hepatopancreática y un menor contenido de Vg en el ovario de hembras expuestas a 5 mg/L del formulado comercial, así como una disminución en el tamaño de los oocitos en hembras expuestas a 1 y 5 mg/L; esta inhibición del crecimiento ovárico fue similar a la observada en N. granulata. Asimismo, se determinaron en P. clarkii los niveles de algunos esteroides sexuales y marcadores de estrés metabólico y oxidativo; los niveles circulantes de estradiol se vieron aumentados en los animales expuestos, demostrando que el descenso en la expresión relativa y en el contenido de Vg ovárica no estaría asociado con una menor secreción de esta hormona. Las hembras expuestas a atrazina mostraron un incremento de lactato y glutatión circulante, indicando un mayor esfuerzo metabólico y una cierta activación de las defensas antioxidantes, en respuesta al estrés generado por el herbicida. En su conjunto, los resultados obtenidos evidencian que el formulado comercial de atrazina utilizado altera la dinámica normal del crecimiento gonadal, en hembras de dos especies de crustáceos y, en consecuencia, podría afectar de manera directa a sus poblaciones, poniendo de manifiesto los efectos nocivos de este tipo de sustancias para el ambiente y los seres vivos que habitan en él.

Las marismas son ecosistemas de pastizal ubicados en la interfase marino-terrestre, regulados por procesos físicos relacionados con la posición relativa en el relieve y los movimientos de las mareas. En los últimos años el corrimiento de la frontera agrícola llevó a la ganadería hacia estas áreas marginales, de alto valor intrínseco por brindar servicios ecosistémicos y ser sustento de una gran biodiversidad. El objetivo general de la tesis fue estudiar los efectos del pastoreo y las mareas sobre el suelo y la vegetación de estos ecosistemas en tres posiciones del gradiente topográfico: alto, medio y bajo. Se utilizó como sistema de estudio una marisma ubicada al sur de la Bahía de Samborombón. Se observó que el pastoreo (0.6 animales.ha-1)favoreció los procesos de compactación del suelo en todo el gradiente y aumentó la salinidad de las posiciones medias y bajas. Asimismo, modificó la composición florística en las posiciones altas y medias y disminuyó la calidad forrajera en todo el gradiente. Los cambios en la composición florística se debieron a una disminución en la cobertura de la especie dominante de la comunidad (Spartina densiflora)y de especies de alta calidad forrajera y un aumento de la cobertura de pastos rastreros y dicotiledóneas en la posición alta y de especies tolerantes a la salinidad en la posición media. A su vez, se encontraron poblaciones de la especie dominante S. densiflora localmente adaptadas a las posiciones altas y bajas en relación a la respuesta a ciclos diarios de inundación salina (simulando la marea). La población proveniente de la posición baja resultó más tolerante a la inundación salina al mantener una baja relación Na+/K+, retrasar la senescencia y mantener la elongación de sus láminas. En conjunto, los resultados encontrados aportan nuevos conocimientos sobre la estructura y funcionamiento de ecosistemas de marisma en relación a los principales disturbios que las afectan. En el aspecto práctico, la información generada servirá como base para plantear objetivos de manejo sustentables compatibles con objetivos de producción y conservación.

La Diabetes mellitus (DM) es un síndrome hiperglucémico que afecta al 7% de la población adulta de nuestro país, y que a largo plazo se asocia con complicaciones macro- y micro-vasculares potencialmente discapacitantes. Algunas de estas complicaciones crónicas (aterosclerosis, nefropatía, retinopatía, neuropatía) constituyen las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes con DM, y por ello se han estudiado sus mecanismos patogénicos con detalle. Sin embargo, existen otras complicaciones tales como las óseas y articulares, que han recibido menor atención en la literatura, pero que contribuyen a disminuir la calidad de vida de los pacientes. En particular, se ha encontrado que a largo plazo, la DM se asocia con pérdida de masa ósea (osteopenia, osteoporosis) y/o disminución en la calidad estructural del hueso, que genera un incremento en el riesgo de fracturas en el esqueleto apendicular.Los pacientes con DM tipo 2 son frecuentemente tratados con antidiabéticos orales (sulfonilureas, biguanidas, tiazolidindionas [TZD] y/o inhibidores de la dipeptidil-peptidasa-4 [DPP-4]), con el objeto de poder lograr un mejor control glucémico. Resulta entonces de interés investigar el posible efecto directo o indirecto de estos antidiabéticos orales sobre el metabolismo óseo, particularmente en vista del efecto deletéreo per se de la DM sobre el hueso. A lo largo de los últimos años nuestro grupo ha estudiado el efecto de la metformina (una biguanida insulinosensibilizante) sobre osteoblastos en cultivo, encontrando que induce en forma directa un incremento en su proliferación, diferenciación y mineralización. En experimentos más recientes, encontramos además que al administrar metformina en el agua de bebida a ratas diabéticas y no diabéticas, induce un efecto osteogénico tanto in vivo (aumentando la masa y celularidad ósea, e incrementando la reparación de una lesión ósea inducida previamente) como ex vivo (estimulando la capacidad osteogénica de células progenitoras de médula ósea aisladas del canal medular diafisario de huesos largos). La dipeptidil peptidasa 4 (DPP-4) es una proteasa de acción extracelular, responsable de la degradación de una familia de hormonas denominadas incretinas, entre las cuales se encuentran el péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP), y los péptidos símil-glucagón tipos 1 (GLP-1). Estas incretinas inducen un estímulo sobre la secreción pancreática de insulina, habiéndose estimado que dan cuenta del 50% de dicha secreción de insulina luego de la ingesta oral de alimentos pero tienen una vida media corta en circulación (1-2 minutos), debido a su rápida degradación por la DPP-4. Se han desarrollado inhibidores selectivos de DPP-4 (sitagliptina, vildagliptina, saxagliptina) para poder incrementar la secreción de insulina estimulada por incretinas en pacientes con DM tipo 2, con el objeto de mejorar su control glucémico post-prandial. El efecto de los diferentes inhibidores de la DPP-4 sobre el metabolismo óseo aún no se ha establecido con claridad. Sin embargo, en estudios con pacientes diabéticos de 24 semanas de duración se encontró que el tratamiento con saxagliptina indujo un incremento de un 67% en la incidencia de fracturas respecto de placebo,dato que se encuentra en elprospecto publicado por la compañía farmacéutica.En base a esta información, se propone para este trabajo de tesis lahipótesis de que la monoterapia con saxagliptina induce efectos deletéreos sobre el hueso, y que dichos efectos pueden prevenirse por el co-tratamiento con metformina. Se investigó el efecto de un tratamiento oral con saxagliptina y/o metformina sobre la micro-arquitectura de huesos largos en ratas control (no diabéticas) y diabéticas, utilizando un modelo animal de ratas con hiperglucemia generada por deficiencia parcial en la producción y secreción de insulina, como consecuencia de la destrucción parcial de las células β del páncreas.Se estudiaron las metáfisis proximales de los fémures, para ello se realizaron cortes histológicos que fueron coloreados con hematoxilina y eosina (H-E) y con Azul Alcian (AA). Además la presencia de osteoclastos se puso en evidencia mediante, la reacción histoquímica fosfatasa ácido tartrato resistente (TRAP). Con el fin de estudiar su mecanismo de acción, se evaluó in vitro el efecto directo de la saxagliptina y su combinación con metformina sobre una línea celular pre-osteoblástica (MC3T3E1) y sobre células progenitoras de médula ósea (CPMO) aisladas del canal medular de ratas no diabéticas. Se realizaron ensayos de proliferación en presencia de mitógenos (Suero Fetal Bovino, Insulina e IGF-1) durante 24hs y ensayos de diferenciación celular hacia el linaje osteoblástico durante 14 o 21 días. Adicionalmente, mediante western blot se determinaron factores de diferenciación tales como Runx-2 y osteocalcina (comprometidos con la osteogénesis), PPARγ (un factor de transcripción adipogénico), las señales mitogénicas mediadas por las quinasas reguladas extracelularmente (ERK) y la activación de la quinasa dependiente de AMPc (AMPK). Al evaluar parámetros histomorfométricos estáticos en los fémures de ratas sanas, encontramos que la saxagliptina indujo efectos deletéreos en la micro-arquitectura del hueso trabecular femoral, que fueron prevenidos cuando se administra conjuntamente con la metformina. En los animales con deficiencia parcial en la secreción de insulina, el análisis de los fémures mostró un gran deterioro del tejido óseo, efecto propio de la enfermedad. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en los parámetros histomorfométricos de fémures de las ratas diabéticas tratadas con saxagliptina respecto a las diabéticas sin tratamiento; mientras que la administración de monoterapia con metformina previno completamente el efecto deletéreo sobre el tejido óseo. Cuando se evaluaron los fémures de estas mismas ratas, pero que fueron tratadas con la combinación saxagliptina-metformina, la mayoría de los parámetros histomorfométricos estudiados alcanzó valores similares a las ratas no diabéticas, sin tratamiento, es decir que mejoró la calidad ósea. Estudios in vitro realizados a corto plazo (24 h) mostraron que la saxagliptina inhibe la proliferación osteoblástica inducida por FBS, insulina e IGF-1 de las células MC3T3E1 y las CPMO; este efecto se encuentra mediado por la activación mediante fosforilación de ERK. Por el contrario, en ausencia de suero o factores de crecimiento la saxagliptina no tuvo ningún efecto per se sobre la proliferación de ambos tipos de células o la activación de ERK. Mientras que en los ensayos realizados a plazos más largo (2-3 semanas demostraron que al añadir saxagliptina al medio de cultivo hay unainhibición tipo dosis-dependiente de la secreción de colágeno tipo 1 y la producción de nódulos de mineralización, así como también una disminución de la expresión de osteocalcina y Runx-2, y un aumento de la expresión de PPARγ en ambos tipos celulares. Por otro lado, previamente hemos demostrado que la metformina tiene efectos osteogénicos directos, incrementando tanto la proliferación y como diferenciación osteoblástica e inhibiendo la diferenciación adipogénica. En el presente trabajo encontramos que la co-incubación de las células en presencia de saxagliptina y metformina previno los efectos negativos en la proliferación y diferenciación celular provocados por el inhibidor de DPP-4. La AMPK es una enzima involucrada en el metabolismo energético de la cual se ha demostrado su importancia en el desarrollo y diferenciación osteoblástica. Previamente hemos demostrado que el mecanismo de acción de la metformina se encuentra mediado por la AMPK, por este motivo investigamos si la monoterapia con saxagliptina o la terapia combinada eran capaces de afectar la activación de esta enzima, encontrando que la activación mediada por metformina no se afecta por el tratamiento con saxagliptina. Resumiendo, este modelo animal junto con los ensayos in vitro realizados, nos ha permitido poner a prueba nuestra hipótesis mostrando que la saxagliptina puede disminuir simultáneamente el compromiso osteoblástico y potencial osteogénico de las células progenitoras de médula ósea y afectar en forma directa la actividad osteoblástica; así como también puede inducir cambios perjudiciales en la microarquitectura de hueso trabecular femoral. Estos efectos fueron prevenidos total o parcialmente con el tratamiento combinado saxagliptina-metformina.

Los hongos micorrícicos arbusculares (HMA)son simbiontes obligados, con un importante rol en el crecimiento de las plantas y en la estructura de la comunidad vegetal. El impacto del glifosato sobre los HMA no ha sido evaluado en pastizales naturales pampeanos, donde es aplicado para promover especies invernales anuales. Se propuso como hipótesis general que el glifosato afectaría negativamente a los HMA directamente sobre las estructuras del hongo expuestas al herbicida, e indirectamente al dañar el vigor de la planta hospedante (dependiendo esto último de la especie vegetal). Primeramente, se evaluó la viabilidad de las esporas y su capacidad de colonizar raíces en suelos de un pastizal de la Pampa Deprimida tratados con la dosis recomendada a campo y con una dosis subletal para las plantas. Se detectó una disminución en la viabilidad de esporas incluso en la dosis subletal y una menor colonización radical y arbúsculos en plantas creciendo en suelos tratados con la dosis máxima. Luego, se discriminaron los efectos directos del glifosato de los indirectos sobre los HMA, utilizando Lotus tenuis y Paspalum dilatatum como plantas hospedantes. Los resultados mostraron que en ambas especies la viabilidad de esporas se vio afectada solamente por los efectos directos del glifosato, la colonización radical fue reducida tanto por los efectos directos como por los indirectos en igual medida, mientras que en el porcentaje de arbúsculos el efecto indirecto fue mayor. Por último, se evaluó el impacto a campo del glifosato sobre los HMA y la vegetación. La viabilidad de esporas se redujo cuando se aplicó la dosis máxima, siendo esta reducción distinta según la especie de HMA. La colonización radical no fue afectada, y el porcentaje de arbúsculos sólo se redujo en P. dilatatum y cuando se aplicó la dosis máxima. Respecto a la estructura de la vegetación, el glifosato provocó una reducción de la cobertura total y un aumento de la de dicotiledóneas no leguminosas. Los resultados respaldan la hipótesis general, ya que el glifosato afectó negativamente a los HMA tanto directa como indirectamente. Sin embargo, la identidad de la planta hospedante no influyó marcadamente los efectos indirectos. Esta práctica de manejo altera el funcionamiento de los HMA en el corto plazo y potencialmente en el largo plazo al alterar la comunidad vegetal. La información generada en esta tesis podrá utilizarse al momento de generar estrategias de manejo más sustentable en estos sistemas.