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Identificación, caracterización parcial y purificación de la UDP: GlC: glicoproteína glucosiltransferasa de hígado de rata, una nueva reacción de procesamiento de glicoproteínas
Eduardo Sergio Trombetta Armando J. Parodi
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
La N-glicosilación de proteínas se inicia en el retículo endoplásmico con la transferencia de un oligosacárido de estructura Glc3Man9GlcNAc2 desde dolicol-P-P a polipéptidos nacientes [1]. El oligosacárido unido a la proteína es inmediatamente procesado por glucosidasas específicas en el lumen del reticulo endoplásmico. La glucosidasa I hidroliza el residuo de Glc más externo en unión α(1,2) y luego la glucosidasa II hidroliza los dos residuos de Glc más internos en unión α(1,3). También pueden removerse algunas manosas por acción de manosidasas en el RE. Luego las glicoproteínas son procesadas a lo largo del camino secretorio por una serie de glicosidasas y glicosiltransferasas, con hidrólisis de restos de manosa, transferencia de N-acetilglucosamina, galactosa, ácido siálico y fucosa, lo que da lugar a la variedad de estructuras encontrada en las glicoproteínas maduras. Por marcación con [14C]glucosa en células de mamíferos, plantas, hongos y tripanosomátidos se detectó la formación de [glucosa-14C]-Glc1Man5-9GlcNAc2 unidos a proteínas [2-10]. Los resultados experimentales indicaban que estos compuestos se formaron en parte por glucosilación de los correspondientes Man5-9GlcNAc2-Prot sin intervención de derivados de dolicol. En todos los casos los restos de Glc fueron removidos y no aparecieron en las glicoproteínas maduras. Se han hecho algunos estudios en sistemas libres de células con microsomas de hígado de rata para estudiar estas reacciones de glucosilación de oligosacáridos unidos a glicoproteínas [10]. En ellos se aprovecharon los aceptores endógenos presentes en los microsomas utilizados comofuente de actividad glucosilante. Con el objeto de estudiar en detalle esta nueva reacción de procesamiento de glicoproteínas ampliamente distribuida en la naturaleza, en el presente trabajo de Tesis se desarrolló un ensayo in vitro específico para esta serie de reacciones. El ensayo utiliza UDP-[14C]Glc como sustrato dador de restos de Glc radioactivos y una glicoproteína con oligosacáridos de tipo polimanosa como sustrato aceptor. Las glicoproteínas deben estar desnaturalizadas para poder actuar como aceptoras. La reacción necesita Ca++y pH neutro. Mediante este ensayo se detectó la actividad de glucosiltransferasa en microsomas de hígado de rata, porotos, Mucor rouxii, Crithidia fasciculata y Trypanosorna cruzi. En el ensayo de actividad de la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa, el resto de Glc es transferido en el mismo tipo de unión α(1,3) y al mismo resto de Man que en el intermediario Glc1Man9GlcNAc2-P-P-dolicol. En Crithidia fasciculata, Leptomonas samueli y Trypanosoma cruzi se encontró una actividad equivalente a la glucosidasa II de otros eucariontes pero no se encontró actividad de glucosidasa I. Estos resultados sugieren que la glucosidasa II es la enzima que hidroliza in vivo los restos de Glc transferidos por este mecanismo. La actividad se localizó por fraccionamiento subcelular en el reticulo endoplásmico. Utilizando vesículas microsomales intactas de hígado de rata se caracterizó a la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa como una proteína soluble del interior del retículo endoplásmico: Mostró latencia para la glucosílación de un aceptor exógeno y fue resistente a proteólisis en dichas vesículas. Se la pudo extraer soluble en medio isotónico con bajas concentraciones de detergentes, mediante métodos mecánicos sin utilizar detergentes y con pH alcalino. Se extrajo en la fase acuosa por partición con Triton X-114. La UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa de hígado de rata se purificó a homogeneidad. En electroforesis desnaturalizante en medio reductor corrió como una única banda de peso molecular aparente 160 kDa y en condiciones nativas se comportó como un homodímero. La enzima pura exhibió las mismas propiedades observadas en preparaciones crudas al desarrollar el ensayo in vitro: pH óptimo neutro, requerimiento absoluto de Ca++ para su actividad y de UDP-Glc como dador de Glc. Reconoció como sustrato aceptor únicamente a glicoproteínas desnaturalizadas y no a las mismas glicoproteínas en estado nativo. Esto no se debió a una diferente accesibilidad del oligosacárido entre la forma nativa y la desnaturalizada sino al reconocimiento por parte de la glucosiltransferasa de algún factor estructural en las glicoproteínas desnaturalizadas. Se generó un antisuero de conejo contra la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa de hígado de rata capaz de reconocera la proteína desnaturalizada y nativa. Se obtuvo la secuencia de amino ácidos del extremo amino terminal y de fragmentos internos de la glucosiltransferasa de hígado de rata. Los datos previos junto con los presentados en esta Tesis permiten en conjunto confirmar la existencia de un mecanismo de transferencia de un resto de Glc a oligosacáridos de tipo polimanosa en glicoproteínas. La glucosiltransferasa involucrada, una proteína soluble del retículo endoplásmico, reconoce como sustratos a glicoproteínas que aún no han adoptado su estructura nativa. La glucosidasa II hidroliza el residuo de Glc transferido por ésta glucosiltransferasa. Este ciclo de glucosilación- deglucosilación continuaría hasta que las glicoproteínas adoptan su estructura nativa y dejan de ser sustrato de la glucosiltransferasa.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1992 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1992
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