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Título de Acceso Abierto

Identificación y caracterización de nuevas CDPKs en la planta de papa: Estudio de su participación en respuesta a infección por P. Infestans. Producción de plantas de papa sobreexpresantes de CDPKs y evaluación de su resistencia

Elisa Inés Fantino Rita María Ulloa

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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
El calcio (Ca2+) es un segundo mensajero esencial en plantas y las quinasas de proteínas dependientes de calcio, CDPKs, son sensores/transductores del catión que se inducen/activan en respuesta a estímulos ambientales. En varias especies de plantas se demostró la participación de CDPKs en vías de señalización que median respuestas defensivas frente al ataque por patógenos (Romeis & Herde 2014). A lo largo de la evolución, las plantas desarrollaron mecanismos de respuesta rápida ante patógenos que involucran cambios en los niveles intracelulares de Ca2+ y en el estado de fosforilación de las proteínas. Las CDPKs poseen un dominio quinasa de proteínas (KD) unido a través de una región bisagra o dominio autoinhibitorio (AD) a un dominio regulador homólogo a la calmodulina (CLD) con 4 sitios de unión al calcio (EF‐hands). En angiospermas, las CDPKs componen familias multigénicas de aproximadamente 30 miembros que presentan gran homología de secuencia entre sí a excepción del dominio amino terminal variable (NTV) que regula la localización subcelular de la enzima y la especificidad de sustrato. En la planta de papa, Solanum tuberosum, nuestro grupo caracterizó tres isoformas de CDPK, StCDPK1, 2 y 3, que se expresan durante el proceso de tuberización (Raíces et al. 2001; Raíces et al. 2003; Gargantini et al. 2009; Giammaria et al. 2011; Grandellis et al. 2012; Santin et al. 2016; Grandellis et al. 2016). Además otros tres miembros de la familia fueron caracterizados por otros grupos, StCDPK4 y 5 (Kobayashi et al. 2007), y StCPK1 (Lakatos et al. 1998). Una búsqueda bioinformática en el genoma de Solanum phureja (PGSC) mostró que la familia CDPK de papa está compuesta por 26 miembros agrupados en los 4 grupos característicos de angiospermas. El grupo I es el más expandido con 12 miembros, el II está compuesto por 7 miembros, el III por 5 y sólo 2 miembros componen el grupo IV. Se encontraron además 3 quinasas de proteínas relacionadas con CDPK (CRKs) que se agrupan en una rama cercana al grupo IV, y una proteína CDPK-like más distante. El análisis evolutivo sugirió que CDPKs, CRKs y CDPK-like comparten un mismo origen evolutivo. El uso de herramientas bioinformáticas permitió inferir diversas características de los miembros de la familia, entre ellas su capacidad de miristoilarse y palmitoilarse, la presencia de péptidos señales a otras organelas y la presencia de motivos PEST. Estudios de expresión y análisis de datos de RNAseq disponibles en la base de datos del genoma de papa permitieron determinar que varias CDPKs presentan una expresión ubicua mientras que un tercio de sus miembros se expresa exclusivamente en órganos florales, mayoritariamente en estambres. Los datos de RNAseq también permitieron identificar CDPKs cuya expresión se induce en respuesta a estreses bióticos. Entre estas últimas, se eligió la isoforma StCDPK7, perteneciente al grupo I, para caracterizarla en profundidad. Se clonó la secuencia codificante que codifica una proteína de 578 aminoácidos, cuyo peso molecular es de 66 kDa y presenta todos los dominios característicos de una CDPK. En su NTV se predijo, in silico, la presencia de un péptido de tránsito a cloroplastos y de dos motivos PEST. Se estudió su patrón de expresión en tejidos por RT-qPCR, se clonó y analizó su secuencia promotora (2.273 pb) y se obtuvieron plantas promStCDPK7::GUS. Tanto la tinción histoquímica como las RT-qPCRs mostraron que la enzima se expresa mayoritariamente en raíces lo que concuerda con los elementos reguladores en cis encontrados en su región promotora. Ensayos de expresión transitoria, en hojas de Nicotiana benthamiana, de las proteína de fusión, StCDPK7:YFP y StCDPK71-157:GFP, mostraron que, en condiciones estándar de cultivo, StCDPK7 presenta localización citosólica y no se encuentra asociada a cloroplastos. Para proceder a su caracterización bioquímica y determinar sus parámetros cinéticos, se obtuvo la proteína recombinante StCDPK7 etiquetada con 6xHis. Se demostró que StCDPK7:6xHis es una quinasa activa dependiente de Ca2+, capaz de autofosforilarse en múltiples sitios en presencia del catión, fosforila diversos sustratos y puede usar Mn2+ o Mg2+ como cofactores del complejo ATP-Me2+. En ensayos de RT-qPCR se observó que la expresión de StCDPK7 aumenta (3,5 veces) en hojas distales de plantas que fueron infectadas con el patógeno hemibiotrófico Phythophthora infestans. Asimismo, se confirmó la inducción, en hojas inoculadas y distales de plantas infectadas, de StPR-1b, gen asociado a la patogénesis y de StPAL1 que codifica una fenilalanina amonio liasa. Se demostró que StCDPK7:6xHis fosforila en forma específica a cuatro proteínas NtPAL de tabaco que presentan un alto grado de homología con las enzimas de papa. Finalmente, se produjeron plantas que sobrexpresan la proteína StCDPK7 (35S::StCDPK7:6xHis) como una primera aproximación funcional para determinar si esta isoforma interviene en la respuesta de la planta a estreses bióticos. Un dato llamativo fue que los niveles del transcripto StPAL1 disminuyeron en estas plantas. La papa es el tercer cultivo alimenticio luego del arroz y del trigo (FAOSTAT, 2009). El oomycete P. infestans, causante del tizón tardío de la papa, ocasiona cuantiosos daños al cultivo en condiciones de alta humedad y bajas temperaturas. Por el momento la única solución para el manejo de la enfermedad es el uso de agroquímicos. Una variante es la generación de plantas resistentes. Es necesario completar la caracterización de las líneas 35S::StCDPK7:6xHis y realizar los ensayos de infección con P. infestans en estas plantas, para determinar si la manipulación biotecnológica de StCDPK7 puede conferir resistencia al oomycete.
Palabras clave – provistas por el repositorio digital

PROTEINAS QUINASAS DEPENDIENTES DE CALCIO (CDPKS); FENILALANINA AMONIO LIASA (PAL); FOSFORILACION DEPENDIENTE DE CA2; PHYTOPHTHORA INFESTANS; REGULACION TRANSCRIPCIONAL; SOLANUM TUBEROSUM; CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASES; PHENYLALANINE AMMONIA LYASE; PROTEIN PHOSPHORYLATION; TRANSCRIPTIONAL REGULATION

Disponibilidad
Institución detectada Año de publicación Navegá Descargá Solicitá
No requiere 2017 Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) acceso abierto

Información

Tipo de recurso:

tesis

Idiomas de la publicación

  • español castellano

País de edición

Argentina

Fecha de publicación

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https://creativecommons.org/licenses/by/2.5/ar/