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Hidratos de carbono en Trypanosoma Cruzi: Estructura de un lipopéptidofosfoglicano

Olga Liliana Casal de Russo Rosa María Muchnik de Lederkremer

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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
El presente trabajo de Tesis tuvo por objeto la determinación de la estructura del lipopeptidofosfoglicano (LPPG) de células epimastigote de Trypanosoma cruzi (cepa Y), agente causante de la enfermedad de Chagas. El LPPB es un componente mayoritario de la membrana de la forma epimastigote, y su rol en el ciclo de vida del parásito no es aún conocido. Se Presentan: 1) Una introducción referida a la enfermedad de Chagas. Se reseñan las características del parásito, la respuesta inmunológica del organismo frente a la infección aguda y crónica, y los modelos experimentales. 2) Un resumen de los distintos estudios químicos realizados sobre la superficie celular del parásito. 3) Los estudios realizados sobre estructura y distribución de glicofosfoceramidas. 4) Un resumen acerca de la importancia de la unión carbono-fósforo como estructura de moléculas complejas, la biosíntesis de ácidos aminofosfónicos, y su identificación por métodos espectroscópicos. 5) Un resumen de los resultados previos sobre el LPPG. 6) La interpretación y discusión de los resultados obtenidos, que incluye: a) Purificacidn y antecedentes del LPPG. Lederkremer y col. [146] aislaron por extracción de células epimastigote de Trypanosoma cruzi con fenol 44%, un complejo de glicoconjugados que se precipitaba con etanol de la fase acuosa. Este complejo estaba compuesto por cuatro bandas (A, B, C y D o LPPG), que se coloreaban con PAS, y se purificaban a través de una columna de Bio Gel P-150. En esas condiciones el LPPG quedaba impurificado con el componente C y se extraía selectivamente con cloroformo:metanol:agua (10:10:3). En este trabajo de Tesis, se obvió la purificación a través de columna, y se extrajo el complejo de glicoconjugados primero con cloroformo:metanol (2:1) para eliminar lipidos contaminantes, luego directamente con cloroformo:metanol:agua (10:10:3). El LPPG se solubiliza en esta mezcla y se precipita por agregado de metanol. Para comprobar la pureza de este producto se lo cromatografió a través de Bio Gel P-150 usando buffer fosfato de sodio 0,1 M (pH=7,2) en presencia de SDS 0,1%, y se obtuvo un único pico. Se había descripto la presencia de un 60% de azúcares en el LPPG, compuestos por manosa, galactosa y glucosa (35:22:1), 1% de glucosamina, 2,1% de fosfato, 12,6% de ácidos grasos ligados como amida y como ester, y 9,5% de péptido. Con estos datos se comenzó el estudio de la estructura del LPPG. b) Estudio de la composición de bases de cadena larga. El hecho de que el ácido lignocérico, que se encuentra ligado como amida en el LPPG, sea un componente común de unidades ceramida; y que un extracto clorofórmico de un hidrolizado ácido total tuviese compuestos ninhidrina positivos [146] llevó a iniciar el análisis de las bases esfingosínicas en la macromolécula. Las bases se cuantificaron luego de hidrólisis alcalina a 100°C y se determinó que en el LPPG había 14,2 mmol% de bases. Al analizar la composición por CGL y CGL-EM se determinó la presencia de 17-metilesfinganina y esfinganina en relación 3:1. Se observo una variación en la composición de bases al analizar otras muestras del LPPG; se identificaron esfingosina y esfinganina. Esta microheterogeneidad en la molécula se encontró también en el LPG de Acanthamoeba castellanii [170]. c) Estudios comparativos realizados en cepa Tulahuen. Los estudios se realizaron para determinar la influencia del medio de cultivo en la composición de bases. Se utilizó una cepa de colección (Tul 0), y se aislaron los complejos de glicoconjugados con fenol 44%, a partir de células epimastigote cultivadas en medio Lit, Boné y bifásico. En todos los casos se encontró 17-metil-esfinganina, esfinganina y esfingosina en una relación aproximada de 88:9:2. Se compararon además los complejos de glicoconjugados de dos líneas de la cepa Tulahuén, una no virulenta (Tul 0), y otra que mantenía su infectividad (Tul 2). En Tul 2 se encontró 17-metilesfinganina como componente minoritario, y esfinganina como mayoritario, en relación 3:17 aproximadamente. Se concluyó que las bases esfingosínicas variarían en las distintas líneas de una misma cepa, y dicha variación no sería dependiente del medio de cultivo. d) Análisis de la ceramida. La ceramida se liberó por hidrólisis alcalina (NaOH 1 N, 2 h, 100°C) y se analizó por RMN H-1. Se observó el doblete a δ=1.1 con J=7 Hz, característico de un grupo isopropilo, lo cual confirmó la presencia de 17-metilesfinganina. Por la proporción de ceramida aislada, se pudo calcular un peso molecular aproximado de 6500 para el LPPG, considerando un mol de ceramida por mol de LPPG. Si se toma el dato cuantitativo de las bases el peso molecular sería de 7100. La ceramida se pudo separar por tratamiento con fosfolipasa C, por lo tanto se deduce que la porción lipídica se encuentra ligada a través de fosfato a la porción hidrofílica. Se determinó además que el hidroxilo de C-3 de la base esfingosínica en la ceramida se encuentra esterificado por ácido palmítico, mayoritariamente. e) Determinación de la presencia de inositol. Se cuantificó el inositol presente en la molécula por CGL y se encontraron 13,8 mmol%. Además se pudo separar un producto de hidrólisis ácida parcial, que al ser rehidrolizado liberaba inositol y glucosamina. f) Caracterización de las distintas uniones de fósforo en el LPPG, lo cual incluye el espectro de RMN P-31. La presencia de fosfato monoéster no se detectó por tratamiento con fosfatasa alcalina del LPPG original. Sin embargo, condiciones alcalinas suaves determinan la ruptura de ciertas uniones fosfodiéster, con la consiguiente formación de monoéster. El tratamiento con ácido dilupido también dio como resultado la formación de fosfato monoéster, que se liberaba por tratamiento con fosfatasa alcalina. El espectro de RMN P-31 a pH=10,5 mostraba un pico principal a δ=+0.67 correspondiente al fosfato diéster y dos señales a δ=+5.29 y +4.83, que se pueden asignar a pirofosfato, comparando con datos de literatura. Las señales de fosfato monoéster aparecen debido al medio alcalino, y podría tratarse de fosfato de serina. Una faceta interesante del espectro fueron las señales a campos bajos, δ=-25.06 y -21.00, características de la unión C-P, las cuales se asignaron como ácido 2-aminoetilfosfónico y ácido 2-amino-3-fosfonopropiónico. En el espectro a pH neutro se observaba una señal ancha y compleja para fosfodiéster centrada a -0.75 ppm, y la señal para unión C-P a -22.08 ppm. g) Estudio de los aminoácidos y ácidos aminofosfónicos en el LPPG. Cuando se trató el LPPG en medio alcalino suave, se observó la liberación de compuestos ninhidrina positivos. Se liberaba el 50% de los aminoácidos, principalmente glicina, serina, treonina, ácido aspártico, que se encontrarían ligados como éster en el LPPG. Se encontró también fosfato de serina, y un aminoácido con tiempo de retención igual al de hidroxilina. Sin embargo, no todos los aminoácidos del LPPG se liberan en esas condiciones, por lo tanto habría una estructura peptídica en la molécula. Se caracterizaron ácido aminofosfonopropiónico como componente mayoritario, y ácido aminoetilfosfónico como minoritario. Por electroforesis en papel, y análisis automático de aminoácidos, además del RMN P-31. La presencia de aminoácidos ligados como éster fue descripta para ácidos teicoicos donde la D-alaina se encuentra esterificando un poliol o un azúcar [246]. h) Caracterización de galactosa furanósica en el LPPG. La hidrólisis ácida parcial del LPPG dio como resultado la liberación diferencial de galactosa con respecto a la manosa. Por oxidación controlada con periodato de la macromolécula, se determinó que esa hexosa se encuentra mayoritariamente en configuración furanósica, y con los hidroxilos de C-5 y C-6 libres. Se caracterizó el azúcar obtenido por oxidación y reducción con NaBH4 del LPPG, como arabinosa. Utilizando NaB3H4 se desarrolló un método para marcar LPPG en forma exógena. i) Identificación de ribosa como constituyente de la macromolécula. La ribosa se caracterizó como azúcar constituyente del LPPG, cuando se sometió a hidrólisis ácida parcial una cantidad apreciable de LPPG. Se descartó la hipótesis de que la ribosa pudiese provenir de contaminación con ácidos nucleicos, pues en esas condiciones se hubiera liberado ribosa-fosfato. La cuantificación luego de una hidrólisis total dió una relación de ribosa, manosa, galactosa y glucosa de 1:14:7:3. Estas proporciones no eran constantes en el análisis de distintas muestras, aunque la manosa, seguida de galactosa, eran siempre los azúcares mayoritarios. j) Determinación de azúcares ligados por fosfato glicosídico. Cuando una muestra de LPPG se sometió a hidrólisis ácida muy suave, se liberó un disacárido sustituído que revelaba con reactivos de ninhidrina y fosfato. Al ser rehidrolizado en condiciones alcalinas, se separaban dos fracciones por cromatografía en una resina catiónica. El análisis por CLAR y CGL indicó que la fracción neutra estaba compuesta por una manobiosa. La fracción ácida contenia diversos componentes ninhidrina positivos; uno de ellos coincidente con el ácido aminofosfonopropiónico, detectados por electroforesis. Por lo tanto la manobiosa se encuentra ligada a la cadena a traves de fosfato glicosídico y sustituída por el ácido fosfónico. k) Estudios de metilación de la cadena de hidratos de carbono. Los resultados de los estudios de metilación del LPPG indican que la galactosa se encuentra presente fundamentalmente en la configuración furanósica, como extremo terminal no reductor. En efecto, no se detectó el 2,3,5,6-tetra-O-metilgalactitol en los estudios realizados en el LPPG degradado por hidrólisis ácida suave. Tampoco se observa en el mismo el 4,6-di-O-metilmanitol, verificando así la ramificación en el hidroxilo de C-3 de manosas unidas (1→2). El hecho de que en el LPPG degradado no se encuentre el 2,4,6-tri-O-metilmanitol indicaría que las unidades de manopiranosa ligadas (1→3) son parte de una cadena externa. Esta correspondería a la manobiosa ligada por fosfato glicosídico y sustituida con ácido aminofosfónico. Las manosas ligadas (1→2) y (1→6) se encontraron en el LPPG original y degradado. l) Análisis del espectro de RMN C-13 del LPPG. El aspecto general del espectro es similar al de los lipopolisacáridos [270]. Se observaron resonancias características de los carbonos anoméricos de azúcares entre 99 y 106 ppm. La señal a 105,8 se asignó a β-D-galactofuranosa. Los carbonos anoméricos de la manosa aparecen como una señal compleja entre 101,2 y 102,9, lo cual refleja las varias uniones de este azúcar [(1→2), (1→3) y (1→6)]. Los resultados obtenidos permitieron postular estructuras parciales de distintos fragmentos del LPPG y comparar una estructura hipotética con la del glicolípido que sirve de ancla a la glicoproteína variante de superficie de Trypanosoma brucei.
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