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Glicoinositolfosfolípidos de Trypanosoma cruzi (epimastigote)

María Isabel Ramírez Rosa María Muchnik de Lederkremer

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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
El objetiVo de la presente Tesis fue la purificación, identificación y caracterización de glicoinositolfosfolípidos de formas epimastigote de Trypanosoma cruzi, cepa Y. Uno de ellos, el lipopéptidofosfoglicano (LPPG) es una glicoinositolfosfoceramida, cuya estructura parcial ya habia sido determinada por los grupos de Lederkremer, Ferguson y Previato (27,28,185,236,237,239,240,241). Este glicoconjugado es uno de los principales componentes de la membrana plasmática de formas epimastigote de T. cruzi. En ésta Tesis se logró purificar a homogeneidad este glicoconjugado y se elucidó la estructura del glicano constituyente del mismo, lo cual estableció su analogía con los glicoinositolfosfolipidos (GIPLs) que actúan de ancla de proteinas a membranasde células eucariote. Por extracción de células del segundo día de cultivo, en iguales condiciones en las que se extrajo el LPPG,se detectaron dos glicoinositolfosfolipidos en cantidades equiparables. El LPPG A, que es un glicoinositolfosfolipido que posee alquilglicerol y el LPPG B que es una glicoinositolfosfoceramida. Se presentan en esta Tesis: 1. Una reseña acerca de las principales caracteristicas de los glicoinositolfosfolipidos (GIPLs). El mecanismo de anclaje de macromoléculas a la membrana plasmática a través de GIPL se ha descripto a lo largo de la última década. Son muchas las proteinas en las que se detectó este tipo de unión covalente, pero sólo se sabe hasta el momento la estructura completa de tres anclas glicolipidicas. 2. Un resumen de las caracteristicas morfológicas y biológicas de nuestro sistema. experimental: el .Trypanosoma cruzi, agente causante de la enfermedad de Chagas. 3. Una actualización de los estudios realizados sobre los diferentes glicoconjugados de membranadel T. cruzi. 4. Un detalle de los resultados previos obtenidos sobre el LPPG por nuestro grupo de trabajo y los grupos de Ferguson y Previato. 5. Los resultados obtenidos a lo largo de esta Tesis. Los mismos se dividen en dos partes: A- La determinación de la estructura completa del glicano del LPPG. B- El estudio de los glicoinositolfosfolipidos en células del segundo dia de cultivo de formas epimastigote de T. cruzi, cepa Y. Estos Capitulos incluyen: A a) La purificación del LPPG. b) La liberación de la fracción lipidica por acción de la enzima PI-PLC y por métodos quimicos. c) El análisis del glicano del LPPG por métodos enzimáticos y por análisis de metilación. d) El estudio espectroscópico de distintos productos de hidrólisis obtenidos a partir del LPPG. e) La determinación de la presencia de CRD sobre el LPPG tratado con PI-PLC. B f) La purificación y separación de dos glicoinositolfosfolipidos de células de T. cruzi del segundo dia de cultivo (LPPG A y B). h) La determinación de la estructura lipidica de los LPPGA y B. i) El análisis estructural del glicano constituyente de los mismos: composición de azúcares, análisis de metilación y determinación de la configuración de la galactosa. j) Determinación de aminoácidos y ácidos aminofosfónicos presentes en ambos compuestos. A a) Purificación del LPPG. Se modificó el esquema de purificación utilizado por Lederkremer y col.(236), introduciendo un paso de extracción con agua saturada en n-butanol (297) y un último paso de purificación por cromatografía de hidrofobicidad en columna de Octyl-Sepharose, obteniendose el LPPG homogeneo. b) Liberación de la fraccion lipidica del LPPG. Acción de la enzima PI-PLC. La enzima fosfatidilinositolfosfolipasa C cliva especificamente la unión inositol-fosfato-lipido en glicoinositolfosfolipidos, obteniéndose el glicoinositolfosfato 1,2 cíclico. Esta reacción se ha utilizado como herramienta para identificar anclas glicolipidicas (17). La acción de ésta enzima sobre el LPPG liberó la ceramida del glicano indicando que el LPPG posee una estructura análoga a las anclas estudiadas hasta el momento. La unión fosfato entre el inositol y el lipido resultó labil a la hidrólisis con HF 50% y con NaOH 1 M o KOH 0,25 M en metanol. c) Análisis del glicano del LPPG. La reacción de desaminación con HNO2 es una reacción caracteristica de las anclas glicolipidicas ya que las mismas poseen glucosamina sin acilar, unida al inositol (28). La obtención de oligosacáridos con 2,5-anhidromanitol en su extremo reductor luego del tratamiento del LPPG con HNO; y reducción con NaBH4 nos indicó la presencia de glucosamina sin acilar en el mismo. Estos oligosacáridos poseen 1 ó 2 galactosas terminales en configuración furanósica, unidas fi(1-3) a dos Man-α(1-2). Las mismas fueron determinadas en el estudio de metilación. El tratamiento de los oligosacáridos con α-manosidasas de distinta especificidad, luego de hidrolizar las galactosas, indicó que los mismos poseen una cadena de α-Man formada por 3 ó 4 unidades. Por el estudio de metilación de determinaron, además de las dos manosas unidas (1-2), una tercera unida (1-6) y la manosa unida a la glucosamina en posición 4. Se determinó también que la GlcNH2 se une a la posición 6 del inositol. d) Estudio espectroscópico del LPPG. Por 31P-RMN se determinó la presencia de la unión fosfonato correspondiente al ácido 2-aminoetilfosfónico. Por el análisis de metilación habiamos determinado que el mismo se une al HO-6 de la glucosamina. La formación del fosfato 1,2-ciclico sobre el inositol luego de la acción de la enzima PI-PLC fue puesta de manifiesto en estos espectros. En el análisis del 1H-RMN se determinó que la Gal se une β(1—3) a las Man-α(l-2), que la glucosamina está en configuración α, corroborándose también los datos obtenidos en el estudio de degradación con α-manosidasas y de metilación. El análisis por FAB-MS de los glicanos del LPPG mostró la microheterogeneidad existente por la diferente sustitución por las galactosas y por el número de manosas. Se observó también la ramificación en la posición H0-3 de la penúltima manosa por Galf. e) Análisis del determinante de reactividad cruzada. Al tratar las anclas glicolipidicas con PI-PLCse expone un epitope llamado CRD o determinante de reactividad cruzada (98). El mismo se localiza sobre el glicano de las anclas y son los epitopes reconocidos en todas las glicoproteinas con ancla glicolipidica. Esta reacción se utiliza como criterio de reconocimiento de proteinas ancladas a membranapor GPI. El CRD se detectó sobre el LPPG por ensayo de ELISA luego del tratamiento con PI-PLC, indicando que éstas moléculas poseen una estructura análoga a las anclas de glicoproteinas a membranas. B f) Purificación de otros glicoinositolfosfolipidos . Utilizando el mismo esquema de purificación del LPPG se obtuvieron, en células epimastigote del segundo dia de cultivo, dos glicoinositolfosfolipidos en cantidades equiparables. Los mismos se separaron en columna de Octyl-Sepharose. Por SDS-PAGE ambos compuestos mostraron un peso molecular semejante entre 7000-12000 Da. g) Estructura lípidica de los LPPGA y B. Los lípidos de ambos compuestos se liberaron con PI-PLC de Bacillus thuringiensis. y Bacillurens, indicando una estructura análoga a los GIPL. Por análisis por c.c.d. y por cgl-em se determinó que el LPPGA posee 1-0-hexadecilglicerol parcialmente acilado con ácido palmitico y el LPPG B posee una ceramida formada principalmente por C18-esfinganina y ácidos palmitico y lignocérico, es decir es semejante al aislado de células de cuatro dias de cultivo. h) Análisis del glicano de los LPPG A y B. Se determinó que en ambos compuestos los azúcares principales eran manosa y galactosa en una relación aproximada de 2,7/1. La glucosamina presente se encuentra unida al inositol y posee AEP unido a uno de sus OH. La galactosa presente se encuentra terminal y en su mayor parte furanósica, pero a diferencia del LPPG del cuarto dia de cultivo también se determinó una cierta proporción de galactosa piranósica. Según el ensayo de metilación, las manosas se encuentran principalmente involucradas en uniones (1-2) y (1-6) y las galactosas sustituyen los H0-3 de las manosas unidas (1-2) ya que se determinó la presencia de 4,6-di-O-metil-manosa. A diferencia del LPPGn de células del cuarto dia de cultivo los LPPG A y B poseen manosa terminal, por lo que no todas las cadenas se encontrarian sustituidas por galactosas. j) Análisis de aminoácidos y ácidos aminofosfónicos. Se determinó en ambos compuestos la presencia de ácido 2-aminoetilfosfónico luego de la hidrólisis con HCl 6 M, 24 h a 100°c. El LPPGA posee un porcentaje mayor de aminoácidos ácidos, como el glutámico y el aspártico, que aminoácidos hidroxilados. En el LPPGB esta relación se invierte al igual que en el LPPG de células del cuarto dia de cultivo. En el LPPGA el 100% de los aminoácidos son saponificables, mientras que en el LPPGB sólo el 66% de los mismos se liberan en condiciones de saponificación. Todos estos resultados nos permitieron determinar que las formas epimastigote de T. cruzi poseen estructuras análogas a los anclas de glicoproteinas a membranas y que las mismas varian en su estructura dependiendo del tiempo de crecimiento de los cultivos. Esta variabilidad se deberia a que los mismos podrian unirse a glicoproteinas en forma selectiva o remodelar sus lípidos a medida que avanza el tiempo de crecimiento y se llega al estado estacionario, detectándose sólo la glicoinositolfosfoceramida en los cultivos de mayor tiempo.
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