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Glicoconjugados de Trypanosoma Cruzi: caracterización de sialoglicolípidos
Adriana Norma Confalonieri de Ozdy Rosa María Muchnik de Lederkremer
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
El presente trabajo de tesis tuvo por objetivo principal, la identificación y caracterización de glicoconjugados, en especial sialoglicolípidos del trypanosomatideo Trypanosoma cruzi. Este protozoario es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Se presentan: 1) Una introducción referida a la clasificación general de los protozoarios, y en particular a los de la familia Trypanasomatidae. Se reseñan las características morfológicas del T. cruzi y su ciclo de vida, así como la forma en que se cultiva axénicamente el parásito. 2) Un resumen sobre la estructura, ocurrencia, función y biosíntesis de los glicoesfingolípidos y gangliósidos de animales vertebrados y una referencia sobre los que se han encontrado últimamente en invertebrados. 3) Los estudios realizados sobre los glicoconjugados componentes de membrana de formas epimastigote de T. cruzi. 4) Los antecedentes que evidenciaban la presencia de ácido siálico en T. cruzi. 5) La interpretación y discusión de los resultados que incluye A) La diferenciación de las distintas fracciones subcelulares de epimastigotes de T. cruzi (cepa Tulahuén) en base a: i) el análisis por electroforesis en geles de poliacrilamida de los glicoconjugados presentes en las mismas. ii) Las características químicas, que incluyen la determinación de proteína y azúcar, la composicion de monosacáridos y la determinación de la ausencia de glucógeno en las mismas, el cual se ha descripto como material de reserva para otros protozoarios. B) La marcación exógena de la membrana plasmática de dos líneas de la cepa Tulahuén (Tul Ø y Tul 2). Se determinó la diferente composición de glicoconjugados de membrana para las dos líneas, la cual difiere también de la cepa Y. En Tul Ø la marca se incorpora principalmente en la glicoproteína de 45 kDa (Gp45) mientras que en Tul 2, se incorpora también en una glicoproteína de 25 kDa. C) Estudios estructurales comparativos realizados sobre Gp45 de Tul Ø y el complejo glicoproteico ABC, de cepa Y. Para ello se aislaron las glicoproteínas de extractos fenol-agua y se determinaron los monosacáridos componentes . Se realizó una hidrólisis alcalina en condiciones de β- eliminación, de las glicoproteínas previamente marcadas con galactosa oxidasa NaBͽH4, y se determinó que en Gp45 y en el complejo ABC, existen oligosacáridos de 4 a 7 unidades de azúcar unidos a través de unión O-glicosídica a la proteína, y que poseen galactosa como uno de sus componentes. Además se determinó la presencia de cadenas unidas a la proteína por otro tipo de unión, aunque no se confirmó la naturaleza de la misma. D) Se realizó un extracto lipídico de las células epimastigote de T. cruzi, el cual se reextrajo con KCl. En este último extracto se determinó la presencia de por lo menos dos componentes que revelaban con reactivo de gangliósidos. Se dosaron 1ع²/² moléculas de ácido siálico / célula, que se liberan del extracto por acción de neuraminidasa. Se determinó también la presencia de azúcar, esfingosina y ácidos grasos en la misma. E) El análisis por EGPA, de epimastigotes marcados con la técnica de NaIO4- NaBͽH4, mostró la incorporación de la radioactividad en dos glicoconjugados, el LPPG (Banda D) y en una banda de alta movilidad (Banda E). Esta última se extrajo con solvente para lípidos, y con KCl. Por fraccionamiento con columna de sílica gel H, de un extracto C:M (2:1) marcado, se obtuvieron dos fracciones A y B. En la fracción A se liberó un 35% de la radioactividad por la acción de la neuraminidasa, mientras que en la B, la marca se incorporaba como arabinosa, lo que sugiere la presencia de galactofuranosa en la misma. F) Se llevó a cabo una incorporación metabólica de (ͽH) ácido palmítico y (ͽH)-galactosa a las células. Se aislaron dos glicolípidos que incorporan ambos precursores (G1Tc y G2Tc). El ácido palmítico se incorporó en una esfinganina en G1Tc y en una esfingenina en G2Tc. Ambos glicolípidos cambiaban su movilidad en c.c.d. por la acción de la neuraminidasa, por lo que se trata de sialoglicoesfingolípidos. Se demostró la naturaleza endógena de los mismos así como también la de los glicoconjugados A, B, C y D. 6) Se aislaron los glicoesfingolípidos G1Tc y G2Tc de un extracto C:M (2:l) de 1ع² células. Para ello se utilizó en primer lugar una resina DEAE-Sephadex en la que se separaron los lípidos neutros de los acídicos. Estos últimos se fraccionaron por columna de Unisil, recogiendo las fracciones que eluían con C:M (8:2) y C:M (1:1). Esta última se recromatografió en una columna de características similares, obteniéndose los dos gangliósidos. H) En la fracción C:M (8:2), se analizaron los ácidos grasos, los azúcares, y las esfingosinas presentes. No se detectó ácido siálico. Del análisis de las distintas c.c.d realizadas sobre extractos provenientes de las marcaciones con ácido palmítico, galactosa, IO4- NaBͽH4 y de las reveladas con reactivos para fósforo y glicolípidos se dedujo que en la misma están presentes por lo menos un glicolípido que se marca con IO4-NaBͽH4 por poseer galactofuranosa, un fosfoglicolípido y fosfolípidos. I) Se analizó la composición de los gangliósidos. Para G1Tc se determina que la relación azúcares neutros: aminoazúcares: ácido siálico: esfingosina es: 4:1:1:1, mientras que para G2Tc la relacion es Azúcares neutros: ácido siálico: esfingosina 5:1:1. Se realizaron hidrólisis ácidas específicas sobre la cadena del oligosacárido de G1Tc. Se determinó que está compuesta por Glucosa:manosa:arabinosa:galactosamina:ácido siálico en relación 2:1:1:1:1. Esta composición es distinta a la de todos los gangliósidos conocidos. Por otra parte éste es el primer informe sobre la presencia de galactosamina en T. cruzi. Los componentes de la ceramida de G1Tc se aislaron por metanólisis y extracción de los ácidos grasos y las esfingosinas, las que se analizaron por c.g.l-e.m. Se determinó que la base de cadena larga presente en G1Tc es una metil esfinganina ramificada de 19 átomos de carbono, la cual se halla esterificada por ácidos grasos en cuya composición se encuentran principalmente ácido 2-metil esteárico (44%), Ac. esteárico (31%), ac. 2-metil palmítico (6,3%), Ac. palmítico (7,3%) y ac. oleico (4,6%). Los ácidos 2-metil ramificados no habían sido informados como componentes de extractos lipídicos de T. cruzi. Por marcación con galactosa oxidasa NaBͽH4, se determinó que la radioactividad se incorpora en galactosamina en G1Tc y en galactosa en G2Tc, lo que descarta también la unión de ambos monosacáridos por el C-6 al oligosacárido respectivo. Asimismo se marcaron los dos gangliósidos con IO4- NaBͽH4. La radioactividad liberada por hidrólisis acida y enzimática, fue la misma en ambos casos, por lo que se concluye que el ácido siálico se encuentra terminal. La movilidad de los gangliósidos marcados es similar a la del gangliósido GM1, lo cual confirma que son monosialilgangliósidos. También se ratificó el cambio en el Rf de los mismos, cuando son tratados con neuraminidasa. Se llevó a cabo una oxidación con periodato de G1Tc. Por c.g.l. se determinó la presencia de sorbitol: glicerol y treitol en relación 2,1:Ø,25, lo que indica que la glucosa no fué oxidada. La presencia de treitol podría deberse a residuos de galactosamina no N-acetilada unida en posición 4. Por metilacidn de G1Tc se determinó que la manosa se halla 2-O-sustituida, confirmando la relación en que se encuentran el glicerol con el sorbitol (1:2), en el análisis de los productos de la oxidación con periodato. Se analizó la composición de la ceramida de G2Tc, utilizando las mismas técnicas que para G1Tc. Se determinó la presencia de esfingosina unida a ácidos grasos en cuya composición se encuentran principalmente ácido 2-metil palmítico (27,1%), ac. 2-metil esteárico (22,6%), Ac. 2-metil araquídico (9,6%), Ac. esteárico (13,3%) y ac. palmítico (9,7%). Los monosacáridos componentes de G2Tc son arabinosa, manosa, galactosa y glucosa. El tratamiento con β-galactosidasa de G2Tc desialidado liberó galactosa, indicando que el ácido siálico terminal se encuentra unido a galactosa, como es común en gangliósidos animales. J) Del extracto lipídico total se aisló un plasmalógeno, por pasaje a través de columna de Unisil y posterior separación de los lípidos más polares por c.c.d. preparativa. El plasmalógeno (PLTc) se hidrolizó con ac. acético y se separó el aldehído del lisofosfolípido por columna de Unisil. Por c.g.l.-e.m. del aldehído reducido al alcohol se determinó la presencia de hexadecanal. El lisofosfolípido se saponificó y se analizaron los ácidos grasos. Por hidrólisis fuerte del plasmalógeno y análisis por c.p. se determinó la presencia de etanolamina. A su vez se dosó el contenido de fosfato en PLTc, que corresponde a un mol de fosfato por mol de plasmalógeno. La movilidad en c.c.d. es similar a la informada para plasmalógenos derivados de fosfatidiletanolamina, por lo que se concluyó que la estructura de PLTc es la representada en la fig 47.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
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No requiere | 1987 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1987
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