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Expresión de antígenos de Trypanosoma cruzi en Escherichia coli y Staphylococcus aureus y su rápida purificación
Juan Ignacio Moreno Víctor Elías Nahmod
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Siendo la enfermedad de Chagas es uno de los problemas endemicos mas importantes en Latinoamerica, el clonado de antígenos del agente causal, Trypanasoma cruzi, ya sea para el diagnostico o el desarrollo de una vacuna, fue uno de los objetivos mas importantes. Uno de los problemas que a menudo se presentan es la forma de obtener proteínas por tecnicas de ADN recombinante, en niveles que puedan ser llevados a escala industrial. En este caso particular, se ha estudiado la forma de expresar eficientemente y purificar cuatro antígenos clonados los que poseen un alto indice de reacción frente a sueros de pacientes con enfermedad de Chagas (Ibañez y col 1987). La expresión y purificación de estas proteinas estuvo basada en un sistema de fusión con la Proteina A de Staphylococcus aureus. Los vectores de expresion usados en este trabajo de tesis fueron los de la serie pRIT. (Nilsson y col, 1990) y sus hospedadores fueron Escherichia coli (E.coli) y Staphylococcus aureus (S.aureus) (Löwenadler y col 1986), siendo este último muy poco estudiado en la expresión de proteinas recombinantes (Nilsson y col, 1990). Una vez que las fusiones fueron expresadas, estas pudieron ser recuperadas y purificadas por cromatografía de afinidad IgG-Sepharosa en un solo paso. El esquema basico de expresión y purificación consistió en lo siguiente: 1) Expresión de la proteina fusión por la bacteria hospedadora ya sea S.aureus como E.coli. 2) Recuperación de la fusión en extractos celulares o en el medio de cultivo libre de celulas por cromatografía de afinidad IgG-Sepharosa. 3) Proteólisis enzimática especifica en el sitio de unión de la proteina A con el antigeno. 4) Eliminación de la proteina A liberada y de la fusión remanente por un segundo pasaje por la columna de cromatografia de afinidad, recuperandose el antigeno auténtico en el efluente. Los resultados en esta primera etapa permitieron extraer las siguientes conclusiones: 1) Las fusiones son principalmente encontradas dentro de la celula en E.coli, mientras que en S.aureus son excretadas al medio de cultivo. 2) Las proteinas de fusión son facilmente rescatadas y purificadas por cromatografía de afinidad. 3) Los niveles de expresión fueron de una magnitud tal que pueden ser llevados a escala industrial tanto en E.coli como en S.aureus. 4) S.aureus probó ser el hospedador de elección porque la degradación proteica fue menor y se evitó el proceso de ruptura celular. Esta ultima ventaja hace que sean procesables grandes volúmenes de cultivo en forma mucho mas rápida y menos costosa. 5) Salvo en un solo caso, la proteólisis especifica separo en forma eficiente, ambas mitades de las fusiones. 6) La ulterior purificación del antígeno auténtico postclivado por un segundo pasaje por la columna de cromatografía de afinidad, mostro una recuperacion de aproximadamente el 80%. En un primer paso, la producción de estos antígenos, por este sistema, para ser usados como reactivo de diagnostico, mostró que puede llevárselo a escala industrial, por los niveles de expresión la facilidad de su manejo y su rapidez. Las hidrofobicidad pareció influir en la degradación de algunas fusiones durante la expresión en este sistema, cuya forma de actuar fue discutida. La metodología empleada para cada antígeno en particular los que en principio serian cuatro, podria ser simplificada aún mas. Esto fue logrado a través de construcciones en la que dos o mas genes fueron fusionados para producir una única proteína que conservaría la misma capacidad de reaccionar con antisueros de pacientes como lo hacen cada uno de ellos por separado. La idea fue aproximarse a la obtención de una poliproteína única que represente a todos los antígenos a disposición de forma tal de expresar, recuperar y purificar todo el "repertorio" en un solo procedimiento. Los resultados obtenidos hasta aqui mostraron que además de ser posible la fusión de tres antíqenos distintos, la inmunoreactividad mostraron que cada antígeno en la molécula única, reaccionó con sus correspondientes antisueros especificos sin interferencia por los demas, demostrando, en primera instancia, que este tipo de quimera puede ser llevada a una prueba de campo. Además queda abierta la posibilidad de que quimeras como las que se construyeron en este trabajo, puedan contribuir a experimentos de protección.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1992 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1992
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