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Estudio transcripcional y post-transcripcional de la quinasa de proteínas dependiente de calcio, StCDPK1 en Solanum tuberosum y análisis de sus potenciales blancos de acción

Franco Santin Rita María Ulloa

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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
La papa, Solanum tuberosum L., es el tercer cultivo alimenticio luego del arroz y del trigo (FAOSTAT, 2009). En el proceso de tuberización, un tallo subterráneo especializado, el estolón, se diferencia en un órgano de reserva, el tubérculo. Con el fin de comprender los mecanismos que subyacen a este proceso de desarrollo y para mejorar la calidad y el rendimiento del cultivo se han realizado numerosas investigaciones. Entre los diversos factores que regulan la tuberización, los cambios en los niveles intracelulares de calcio y en el estado de fosforilación de las proteínas son eventos primarios que coordinan en tiempo y forma la respuesta de la planta. El calcio es un segundo mensajero esencial en plantas y las quinasas de proteínas dependientes de calcio, CDPKs, son sensores/transductores del catión que se inducen/activan en respuesta a estímulos bióticos y abióticos (Boudsocq & Sheen 2013). Estas enzimas monoméricas poseen un dominio quinasa de proteínas (DK) unido a través de una región bisagra o dominio autoinhibitorio (DAI) a un dominio regulador homólogo a la calmodulina (CLD) con 4 sitios de unión al calcio (EF-hands). Componen familias multigénicas compuestas por aproximadamente 30 miembros que presentan gran homología de secuencia entre sí a excepción del dominio amino terminal variable (NTV) que regula la localización subcelular de la enzima. En Solanum tuberosum, nuestro grupo identificó tres isoformas de CDPK, StCDPK1, 2 y 3, que se expresan durante el proceso de tuberización (Gargantini et al. 2009; Giammaria et al. 2011; Grandellis et al. 2012; Raices et al. 2001; Raices et al. 2003a; Raices et al. 2003b; Raices et al. 2003c). Con el fin de estudiar la regulación transcripcional de la isoforma StCDPK1 durante el ciclo de vida de la planta de papa, se clonó y analizó su secuencia promotora, se obtuvieron y caracterizaron plantas transgénicas de papa que expresan el gen reportero β-glucuronidasa (GUS) bajo dicho promotor (plantas StCDPK1pro::GUS) y se realizaron ensayos de qRT-PCR en diferentes tejidos de la planta y estadios de tuberización. Se comparó la actividad GUS observada en las plantas StCDPK1pro::GUS con la observada en plantas CDPK3pro::GUS desarrolladas previamente (Grandellis et al. 2012) y con la de plantas CDPK2pro::GUS obtenidas también durante el transcurso de esta tesis. Los ensayos histoquímicos indican que la isoforma StCDPK1 está fuertemente asociada al sistema vascular de la planta y confirman que presenta una expresión espacio temporal definida durante el proceso de tuberización. Asimismo se analizó si la expresión de StCDPK1 podía ser regulada post transcripcionalmente por microARNs. A través de los programas online psRNATarget y TargetAlign se identificó el miR390 que tendría como blanco el transcripto de StCDPK1 provocando el clivaje del ARNm o interrumpiendo su traducción. Los perfiles de expresión opuestos del miR390 y de StCDPK1 en estadíos de tuberización indicaron que este miARN podría regular la expresión de StCDPK1. Posteriormente, en ensayos de co-agroinfiltración en Nicotiana benthamiana se determinó que los transcriptos de StCDPK1 son blanco de acción del miR390, demostrando, por primera vez, que una CDPK es regulada a este nivel (manuscrito enviado a Plant Mol. Biol). Además se obtuvo la proteína recombinante StCDPK1 etiquetada con 6xHis para proceder a su caracterización bioquímica y determinar sus parámetros cinéticos. Se demostró que la proteína 6xHis-StCDPK1 es una quinasa activa dependiente de calcio, capaz de autofosforilarse en presencia del catión y que fosforila diversos sustratos, entre los cuales se encuentra AtDi19, un factor de transcripción involucrado en la respuesta a estrés salino y sequía en Arabidopsis thaliana. Recientemente obtuvimos las proteínas recombinantes del homólogo de AtDi19 en papa y otras dos proteínas que han sido implicadas en la inducción de la tuberización, la proteína StSP6A, homólogo en papa de flowering locus T (FT) y StPIN4, un transportador de auxinas. Próximamente se ensayará la capacidad de la enzima de fosforilar in vitro a estos sustratos. Finalmente, se produjeron plantas que sobrexpresan la proteína StCDPK1 como una primera aproximación funcional para determinar si esta isoforma interviene en la respuesta de la planta a estreses abióticos.
Palabras clave – provistas por el repositorio digital

STCDPK1; FOSFORILACION DEPENDIENTE DE CALCIO; REGULACION TRANSCRIPCIONAL; REGULACION POSTRANCRIPCIONAL POR MICRO ARNS; TUBERIZACION; CALCIUM DEPENDENT PHOSPHORYLATION; TRANSCRIPTIONAL REGULATION; POSTRANSCRIPTIONAL REGULATION BY MI RNAS; TUBERIZATION

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tesis

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