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Estudio de las bases moleculares responsables de los fenotipos D negativo y D variante del sistema Rh en la población argentina: Importancia clínica

Carolina Trucco Boggione Carlos Cotorruelo

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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
El sistema Rh es el grupo sanguíneo más complejo y polimórfico de la membrana eritrocitaria. Presenta un gran interés clínico en Medicina Transfusional, Obstetricia y Hematología, debido a la participación de sus anticuerpos en los procesos de destrucción inmune de los glóbulos rojos. Los antígenos Rh desempeñan un papel central en las reacciones hemolíticas transfusionales, en la inmunización de pacientes politransfundidos, en la patogénesis de la Enfermedad Hemolítica Fetoneonatal y en algunas Anemias Hemolíticas Autoinmunes. El locus RH está compuesto por dos genes denominados RHD y RHCE que codifican para las proteínas transmembranales RhD y RhCE portadoras de los antígenos D y C, c, E, e, respectivamente. La presencia o ausencia del gen RHD en el ADN humano determina las bases moleculares del polimorfismo asociado a los fenotipos D positivo y D negativo. Los individuos D positivo poseen uno o dos genes RHD por célula; mientras que el fenotipo D negativo resulta de la ausencia del gen RHD, siendo las personas D negativo homocigotas para la deleción de este gen. Sin embargo, se ha reportado que existen numerosas variantes alélicas responsables de un fenotipo D negativo que dan origen a proteínas RhD que no expresan los epitopes del antígeno D o no se ensamblan en la membrana eritrocitaria. Además, se han descripto fenotipos D variante (Dvar) generados por distintos eventos moleculares que conducen a una expresión alterada de la proteína RhD. Dentro del fenotipo Dvar, las variantes cualitativas o fenotipo D parcial se caracterizan por la ausencia de algunos epitopes D mientras que las variantes cuantitativas, fenotipo D débil, presentan una expresión disminuida de todos los epitopes D. Los individuos con fenotipo D parcial pueden desarrollar aloanticuerpos anti-D hacia los epitopes que no poseen si son desafiados con eritrocitos D positivo. Por el contrario, las personas con fenotipo D débil no son susceptibles de desencadenar eventos de aloinmunización. Debido a la incapacidad de los métodos serológicos para discriminar entre fenotipo D parcial y D débil, los pacientes con un fenotipo Dvar deben ser considerados D negativo para transfusiones o embarazos. Por otro lado, el fenotipo DEL se caracteriza por presentar una expresión mínima del antígeno D en la membrana del glóbulo rojo. Debido a la dificultad para identificar el fenotipo DEL mediante las técnicas serológicas convencionales, la mayoría de los donantes portadores de estas variantes son tipificados erróneamente como D negativo, con el riesgo potencial de inducir una aloinmunización en receptores D negativo. El gran número de variantes fenotípicas descriptas y la elevada variabilidad en los patrones de reactividad que éstas presentan con los antisueros monoclonales restringen la aplicación de métodos serológicos para su correcta determinación. La caracterización molecular de las variantes alélicas resulta un recurso apropiado para resolver los problemas en aquellas situaciones clínicas donde la serología presenta limitaciones. Debido a la elevada variabilidad genética interpoblacional del sistema Rh, es de fundamental importancia establecer el polimorfismo molecular del locus RH en individuos de nuestro país con miras a implementar un abordaje inmunohematológico basado en estudios moleculares. En este trabajo de Tesis hemos investigado las bases genéticas del locus RH en nuestra población para aportar nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares responsables del fenotipo D negativo y fenotipos con expresión débil del antígeno D. Se analizaron 1120 muestras de donantes que concurrieron a bancos de sangre y efectores de salud de Tucumán, Córdoba, Rosario, La Plata y CABA. Dentro de este grupo, se estudiaron 796 muestras con fenotipo D negativo portadoras de los antígenos C y/o E y 324 muestras con fenotipo D variante. Además, se investigó la presencia del marcador genético RHDΨ, característico de individuos de la etnia africana, en 221 muestras con fenotipo dccee provenientes de Tucumán y 1200 de Rosario, y el alelo DI*A, marcador genético de la etnia amerindia en 178 muestras de Tucumán y 150 provenientes de Rosario. En todas las muestras se realizaron estudios serológicos y moleculares. Se evaluó la presencia de los antígenos del sistema Rh mediante técnicas de hemaglutinación. Los fenotipos DEL fueron identificados por ensayos de adsorción y elución. Además, se realizaron estudios de los niveles de expresión del antígeno D por citometría de flujo. Se investigó la presencia del gen RHD mediante una estrategia de PCR multiplex basada en el polimorfismo de longitud del intrón 4 y en la presencia de una secuencia específica en la región 3' no codificante del gen RHD. Se diseñaron diferentes estrategias moleculares de PCR para caracterizar los mecanismos moleculares responsables de los fenotipos D observados. También se utilizaron técnicas de microarreglos de ADN y secuenciación para definir nuevos polimorfismos. Los estudios de detección del gen RHD por la estrategia de PCR multiplex realizados en este trabajo de Tesis permitieron identificar la presencia de fragmentos del gen RHD en 133 (16,71%) de las 796 muestras con fenotipo D negativo estudiadas (muestras D-/RHD+). Estos resultados mostraron que el fenotipo D negativo no es generado sólo por un evento de deleción del gen RHD en individuos de nuestra población. A través de las distintas estrategias moleculares utilizadas en este trabajo se caracterizaron variantes RHD nulas y DEL generadas por eventos de conversión génica entre alelos RHD y RHCE, deleción e inserción de nucleótidos, mutaciones de cambio de sentido y mutaciones sin sentido en muestras D negativo C/E positivo. Los estudios realizados detectaron 98 individuos (12,31%) portadores de alelos RHD nulos y 19 (2,39%) portadores de alelos DEL. Dentro de este grupo se caracterizaron las variantes alélicas no reportadas RHCE(1-2)-RHD(3361_371del11-10), RHD(329T>C)-CE(3-9)-D, RHD(581insG) y RHD(1001T>A) responsables de un fenotipo D negativo y el alelo RHD*1248insG que origina un fenotipo DEL. Se observó que la prevalencia de individuos portadores del nuevo alelo nulo RHD*581insG, responsable de la generación de la una proteína RhD truncada que no expresa epitopes D en la membrana eritrocitaria, fue significativamente mayor en las muestras provenientes de Tucumán que en las del resto de las regiones analizadas. Por otro lado, en este trabajo de Tesis se analizó la distribución del marcador genético DI*A, característico de la etnia amerindia con ascendencia asiática, en muestras provenientes de Tucumán y de Rosario. Los resultados mostraron una proporción significativamente mayor de individuos portadores de la variante DI*A en muestras de Tucumán, sugiriendo un aporte superior de la etnia amerindia a esta población. Considerando que la variante RHD*581insG no ha sido reportada en poblaciones caucásicas europeas, africanas ni asiáticas y que fue detectada con una alta prevalencia en una región donde el aporte amerindio al acervo genético de la población es mayor que en otras áreas geográficas, el nuevo alelo RHD*581insG podría asociarse a la etnia amerindia. Por otro lado, la variante alélica híbrida RHD-CE-Ds, característica de individuos de la etnia africana, fue detectada en el 43,61% de las muestras D-/RHD+ de todas las regiones estudiadas, siendo Tucumán la región con el mayor porcentaje observado. Además, los estudios de secuenciación permitieron caracterizar los mecanismos moleculares responsables del alelo DEL RHD*46C en muestras con expresión del antígeno E. Esta variante alélica fue detectada con mayor prevalencia en muestras provenientes de Rosario y Tucumán. En el grupo de muestras con fenotipo D negativo C/E positivo se detectaron también 15 portadoras del alelo híbrido RHD-CE(3-9)-D. En 7 de estas muestras se identificó el SNP característico del alelo RHD*DVII. Estos hallazgos permiten suponer que la nueva variante híbrida RHD(329T>C)-CE(3-9)-D es producto de una conversión génica entre los alelos RHD*DVII y RHCE*Ce. Debido a que ambas variantes son características de individuos caucásicos, los resultados sugieren que el nuevo alelo surge del aporte europeo a la población de nuestro país. Por otro lado, en este trabajo de Tesis se caracterizaron los eventos moleculares responsables de la generación de las nuevas variantes alélicas RHCE(1-2)-RHD(3361_371del11-10) y RHD*1001A, responsables de un fenotipo D negativo. Hemos demostrados por estudios de adsorción elución que ambas variantes codifican para un polipéptido RhD aberrante y no expresan epitopes D. Estos nuevos alelos fueron incorporados al grupo de las variantes RHD nulas. Además, se identificó una muestra portadora del nuevo alelo RHD*1248insG responsable de un fenotipo DEL. Esta variante alélica genera una proteína RhD de mayor tamaño. Estudios de adsorción-elución permitieron detectar cantidades mínimas del antígeno D en la membrana eritrocitaria. Estos hallazgos sugieren que la proteína RhD aberrante sería capaz de integrarse en la membrana del glóbulo rojo y expresar epitopes D. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis demuestran la importancia de conocer la variabilidad alélica que subyace en el locus RH de individuos de nuestra población para desarrollar estrategias de genotipificación RHD que disminuyan la posibilidad de obtener resultados falsos positivos. El diseño de estudios moleculares que incluyan la caracterización de alelos RHD nulos optimizará el diagnóstico prenatal no invasivo del genotipo RHD, asegurando una estricta correlación entre el genotipo y el fenotipo fetal. Además, el conocimiento de las bases moleculares de los alelos DEL asociados a los diferentes grupos étnicos resulta fundamental para desarrollar estrategias de genotipificación en individuos D negativo. En este trabajo de Tesis hemos identificado un 2,39% de individuos portadores de alelos DEL. Estos hallazgos demuestran la importancia de implementar estrategias moleculares en las muestras D negativo C/E positivo para detectar polimorfismos responsables de fenotipos aparentes D negativo capaces de generar una aloinmunización en receptores D negativo. Por otro lado, hemos investigado los mecanismos moleculares del polimorfismo del locus RH en individuos portadores de variantes alélicas RHD responsables de fenotipos con expresión débil del antígeno D en nuestra población. Utilizando estrategias de biología molecular se identificaron alelos D parcial generados por conversión génica entre alelos RHD y RHCE o por SNPs y alelos D débil producto de mutaciones de cambio de sentido. Debido a la dificultad para discriminar serológicamente a las variantes cualitativas, actualmente los pacientes portadores de un fenotipo Dvar se consideran en riego de desarrollar una inmunización anti-D y por lo tanto, son tratados como D negativo para transfusiones o embarazos. Sin embargo, numerosas evidencias clínicas han demostrado que individuos portadores de los alelos D débil tipo 1, 2 y 3 no son susceptibles de aloinmunización anti-D ante una exposición a glóbulos rojos D positivo. Los estudios moleculares de las muestras con fenotipo Dvar mostraron que un 58,02% de los individuos resultaron portadores de alelos D débil tipo 1, 2 o 3. Los resultados indican que más del 60% de los individuos pertenecientes a las ciudades de la región central del país presentaron una expresión aberrante del antígeno D producto de estas variantes alélicas. Sin embargo, en Tucumán la distribución fue menor al 37%. Los análisis estadísticos indicaron que la probabilidad de encontrar un individuo portador de estos alelos en las muestras provenientes de Tucumán fue significativamente menor que para las otras 4 ciudades analizadas donde esta proporción no mostró diferencias significativas. El predominio de alelos D débil tipo 1, 2 y 3, característicos de caucásicos, indicaría un mayor aporte de europeos al acervo genético de la población de la región central del país. La implementación de estrategias moleculares que permitan detectar estas variantes en pacientes que presentan un fenotipo Dvar permitirá optimizar el uso de las escasas unidades D negativo disponibles en los servicios de Medicina Transfusional y reservarlas exclusivamente para los pacientes que se encuentran en riesgo real de desarrollar una respuesta aloinmune hacia el antígeno D. Además, en el grupo de muestras con fenotipo Dvar se caracterizaron los mecanismos moleculares responsables de variantes alélicas D parcial. Los resultados obtenidos mostraron una alta prevalencia de individuos portadores de alelos RHD parcial RHD*DVI (4,63%). Debido a que estas variantes alélicas generan una proteína RhD que carece de algunos epitopes D, los individuos portadores de estos alelos son susceptibles de desarrollar aloinmunización anti-D. La caracterización molecular de las variantes cualitativas en los servicios de Medicina Transfusional de nuestra población evitará posibles incompatibilidades Rh. Por otro lado, se identificaron variantes genéticas RHD producto de mutaciones de cambio de sentido no reportadas. Uno de los nuevos alelos identificados fue registrado y denominado D débil tipo 93 por la Sociedad Internacional de Transfusión Sanguínea (ISBT). Cabe destacar que, de las 31 muestras portadoras de la nueva variante hallada en este trabajo de Tesis, 20 (64,52%) corresponden a donantes provenientes de Tucumán. Teniendo en cuenta que el marcador genético DI*A demostró una mayor influencia amerindia en la región norte del país, la presencia de este alelo podría atribuirse al aporte de esta etnia al acervo genético de la población tucumana. Además, se identificaron 4 nuevas variantes alélicas RHD*325G, RHD*763A, RHD*764A y RHD*911A. Las sustituciones aminoacídicas generadas por estos SNPs provocarían alteraciones en el plegamiento de la proteína RhD que modificarían el correcto ensamblaje del polipéptido RhD en el complejo Rh alterando la expresión de los epitopes D. La discriminación entre variantes cuantitativas y cualitativas es de fundamental importancia en los bancos de sangre para optimizar la compatibilidad transfusional y garantizar la provisión de sangre segura, y en Obstetricia para definir estrategias de intervención médica en las embarazadas. Los hallazgos obtenidos en este trabajo de tesis sobre los mecanismos genéticos responsables de la variabilidad alélica del locus RH en la población argentina, tendrán su correlato en la implementación de estrategias moleculares como herramientas de laboratorio para la asignación precisa e inequívoca de las variantes antigénicas de importancia clínica. Teniendo en cuenta los estudios sobre el polimorfismo molecular del locus RH en nuestra población realizados en este trabajo de Tesis, se diseñó y evaluó un protocolo de genotipificación RHD fetal no invasivo con el objetivo de implementar a futuro una estrategia que contribuya al diagnóstico de la EHFN en embarazadas aloinmunizadas con anti-D y que permita optimizar el uso de la inmunoprofilaxis en mujeres D negativo no sensibilizadas. Considerando la alta prevalencia de alelos RHD silentes y DEL en nuestra población, el diseño de la estrategia de genotipificación prenatal debe tener en cuenta la variabilidad alélica del locus RH para asignar un correcto fenotipo. El algoritmo diseñado en este trabajo propone el estudio del ADN genómico materno para detectar mujeres embarazadas portadoras de alelos RHD y el análisis del ADN genómico paterno en aquellas situaciones donde los resultados obtenidos en el estudio del ADN libre por PCR en tiempo real no son concluyentes. Se realizaron estudios serológicos y moleculares en la sangre de los recién nacidos para correlacionar con los hallazgos moleculares obtenidos en el ADN libre con el fenotipo D eritrocitario de los neonatos. Los resultados obtenidos permitieron asignar el genotipo RHD fetal en el 98,99% de las muestras de plasma materno estudiadas. La correlación entre los resultados moleculares y serológicos mostró que la estrategia de genotipificación RHD prenatal presenta una sensibilidad del 100% al no obtener resultados falsos negativos y una especificidad del 98,81% al detectarse sólo un falso positivo, debido a la presencia de una variante alélica responsable de un fenotipo D negativo. El protocolo diseñado para la detección del gen RHD en ADN fetal libre en plasma materno demostró ser una herramienta útil para la determinación del estatus D del feto en nuestra población. La correcta genotipificación RHD prenatal permitirá diagnosticar fetos en riesgo real de EHFN y definir estrategias de administración de la profilaxis con inmunoglobulina anti-D exclusivamente a embarazadas cuyos fetos son D positivo.
Palabras clave – provistas por el repositorio digital

Sistema Rh; Glóbulo Rojo; Caracterización Genética

Disponibilidad
Institución detectada Año de publicación Navegá Descargá Solicitá
No requiere 2017 Repositorio Hipermedial UNR (SNRD) acceso abierto

Información

Tipo de recurso:

tesis

Idiomas de la publicación

  • español castellano

País de edición

Argentina

Fecha de publicación