Catálogo de publicaciones - tesis

Compartir en
redes sociales

Título de Acceso Abierto

Efectos del sistema regulador CreBC sobre el flujo de carbono en Escherichia coli y su manipulación para incrementar la síntesis de compuestos de interés industrial

Manuel Santiago Godoy María Julia Pettinari

publishedVersion.

Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
La supervivencia de un organismo depende, al menos en parte, de su habilidad para sensar y responder a cambios en el ambiente. En las bacterias, los cambios en las características físicas y nutricionales del ambiente generan respuestas inmediatas, a través de la regulación de conjuntos de genes en respuesta a un estímulo específico del ambiente y a señales metabólicas. En el presente trabajo se evaluó el efecto de cambios en CreC, el sensor del sistema regulador de dos componentes CreBC, sobre el metabolismo central de E. coli. Se estudió el efecto de mutaciones en el gen creC en cepas crecidas en medio mineral M9 con glucosa y glicerol como fuente de carbono, y en distintas condiciones de aerobiosis. La ausencia de CreC generó mayores efectos en M9 glucosa y en bajas tensiones de oxígeno tanto para la secreción de metabolitos (acetato, formiato, lactato y succinato) como para las actividades enzimáticas acetato quinasa (ACK) y lactato deshidrogenasa (LDH). De los cuatro metabolitos mencionados, la cepa ΔcreC (DC1060) produjo más acetato, formiato y succinato y menos lactato, y reportó una mayor actividad ACK y menor actividad LDH. El estudio de los niveles de transcripción a través de fusiones trascripcionales del gen gfp (codifica la proteína verde fluorescente, Gfp) a los promotores de los genes de las enzimas estudiadas ackA (ACK) y ldhA (LDH) confirmaron que la menor actividad LDH de la cepa DC1060 se correspondía con niveles inferiores de transcripto del gen (en la fase exponencial). Para la fusión ackA-gfp, en cambio, los niveles de transcripción fueron leve pero significativamente menores en la cepa mutante respecto a la salvaje (K1060) en esta fase, en contraposición a lo observado para la actividad ACK. La trascripción de este gen en la fase estacionaria, pasó a ser mayor en la cepa DC1060, demostrando un alto nivel de complejidad en la dinámica regulatoria de CreC sobre ackA. Mediante estudios similares a los antes descriptospero realizados con mutantes para los genes ΔcreB, ΔcreC y la doble mutante ΔcreBC, se estableció que los efectos de CreC están mediados exclusivamente por CreB. Se realizaron ensayos fisiológicos en los que se observó que la cepa mutante es más sensible a agentes oxidantes como el peróxido de hidrógeno y el paraquat, probablemente como resultado de un estado intracelular más oxidado respecto de la cepa salvaje (como se pudo establecer a partir de los coeficientes [estanol]/[acetato], y los niveles de NADH/NAD+ intracelulares). También se observó que esta cepa tiene un consumo de oxígeno más bajo (- 30%) que la salvaje. Se realizaron ensayos en biorreactor con diferentes niveles de aireación (bajo, medio y alto) y dos fuentes de carbono (glicerol y glucosa) para caracterizar fermentativamente a las cepas K1060 y DC1060, a fin de establecer una estrategia para mejorar la producción de succinato y PHB, en conjunto con los resultados mencionados. Las mayores diferencias entre ambas cepas se observaron nuevamente a bajas concentraciones de oxígeno. De estas diferencias se destacan los siguientes resultados: (i) No hubo producción de lactato, y los niveles de etanol fueron muy bajos para ambas cepas y fuentes de carbono; (ii) el succinato fue detectable sólo en la cepa mutante con glucosa, pero a niveles inferiores que los obtenidos en los cultivos de frasco agitado; (iii) el formiato y el acetato, en medio mineral con glucosa, se produjeron en mayor cantidad para la cepa ΔcreC; (iv) la relación [etanol]/[acetato] volvió a reflejar un estado de mayor oxidación intracelular en la cepa ΔcreC (sólo con glucosa); (v) en glicerol como fuente de carbono, se observó un lag más pronunciado y una mayor energía de mantenimiento en la cepa DC1060 respecto a la K1060. Cuando se evaluó la producción de PHB mediante la expresión heteróloga de los genes phaCAB de R. eutropha, se vio que en glucosa la cepa mutante produce casi un 50% más de este polímero. Al probar los efectos del bicarbonato sobre la producción de succinato, vimos que la síntesis de este último aumentaba sólo en la cepa mutante. Para ver si era posible mejorar la producción de estos metabolitos, construimos una colección de cepas con distintas mutaciones de forma de anular las vías metabólicas competitivas. Estas mutaciones involucraron a los genes ackA, ldhA, ptsG, adhE y, por su puesto, creC. En el caso del PHB, ninguna de las cepas mejoró el desempeño de la simple mutante ΔcreC, quizás debido a que ya se alcanzó el máximo nivel de polímero tolerable por la célula. En el caso del succinato, además se sobre-expresaron dos carboxilasas de E. coli (la PEP carboxilasa y la PEP carboxiquinasa), cada una en combinación con la enzima formiato deshidorgenasa (Fdh1) de Candida Boidinii. De las distintas combinaciones estudiadas, la cepa que tuvo mayor producción de succinato fue la triple mutante ΔcreC, ΔackA, ΔadhE, sobreexpresando las enzimas PEP carboxilasa y la Fdh1, llegando a alcanzar una concentración de 6 mM de succinato.
Palabras clave – provistas por el repositorio digital

No disponibles.

Disponibilidad
Institución detectada Año de publicación Navegá Descargá Solicitá
No requiere 2014 Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) acceso abierto

Información

Tipo de recurso:

tesis

Idiomas de la publicación

  • español castellano

País de edición

Argentina

Fecha de publicación

Información sobre licencias CC

https://creativecommons.org/licenses/by/2.5/ar/