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Determinación cromatográfica de Colina, Colamina y Serina en la fracción fosfolípidos de germen de trigo y en la lecitina de soya
María Lydia Pisarello Adorni Jorge R. Mendive
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Sobre fosfátidos de vegetales, cuyos principales componentes nos propusimos determinar en el presente trabajo, la bibliografía es bastante menor que en caso de fosfolípidos de fuentes animales. La cantidad de fosfátidos presente en soya y trigo varía con el procedimiento de extracción, procedencia de la muestra, calidad de la misma, época del año etc, hallándose para soya valores desde 1,5% hasta 3,2% y de 0,6% hasta 1,6% on germen de trigo. Los constituyentes de los fosfolípidos en vegetales se identificaron con los de fuentes animales, con la única diferencia de no haberse hallado esfingomielina en los primeros, hasta el presente,. La característica de fosfolípidos de soya y trigo en su existencia en forma de complejos carbohidrato- fosfátido proteína, cuya naturaleza, en la mayoría de los casos, no es de tipo químico, ya que los fosfátidos se liberan totalmente por acción de solventes específicos. Para la determinación de los fosfátidos totales, es necesario una extracción completa del material y valoración de los mismos en el extracto. Se trabajó con un germen de trigo argentino, procedente de Pergamino. Luego de una molienda conveniente del germen, se lo extraía de acuerdo a la técnica de Rewald (1937) C.A. 31,6354. en un aparato continuo con una mezcla de benceno-alcohol(4:1) durante 36 hs o igual tiempo con alcohol de 96%. Una vez aislados los fosfolípidos, pueden seguirse 3 caminos para su valoración: a) el método oxidativo o de Bloor, b) por el contenido en ácidos grasos y c) por determinación del contenido en P. Este último método es el más común y exacto, por la cantidad de técnicas existentes para valorar este elemento y fué el adaptado por nosotros. Para ello, el residuo, de la extracción, luego de eliminar el solvente y secado convenientemente a vacío, se sometía a hidrólisis con ClH 6N a ebullición durante 24 hs, con el objeto de liberar las bases nitrogenadas de los fosfátidos, de la unión con el ácido fosfórico, obteniéndose así ác. fosfóglicérico clorhidrato de colina, colamina, serina y ácidos grasos, que se eliminan luego por filtración. Sobre ese hidrolizado se determinaba P y las bases nitrogenadas. Para P, se usó un método colorimétrico, debido a Beveridge y Johnson (l949) Can. J. Research 27, E, 159, consistente en la conversión del ác. fosfórico a ác. fosfomolíbdico y su posterior reducción a azul de Mo. El reactivo consistía en Sulfato de hidrazina-molibdato de sodio. El color azul obtenido era estable 24 hs y su intensidad se medía con el espectrofotómetro. De todas las determinaciones efectuadas sobre 2 muestras distintas de germen de trigo, se obtuvo el valor promedio de 1,58% de fosfátidos totales, con un máximo de 1,6% y un mínimo de 1,57%. Con igual técnica se analizaron 2 muestras de Lecitina de soya comercial, hallándose un promedio de 49,76% de fosfátidos totales. La determinación en los constituyentes principales de los fosfátidos es importante por su rol en los procesos metabólicos. Para ello pueden separarse previamente las distintas fracciones que los contienen: lecitinas, cefalinas e inositol fosfátidos y determinar cada una en la fracción correspondiente o bien valorarlas directamente en el hidrolizado. Este último es lo más aceptable para microcantidades como en nuestro caso, ya que está sujeto a menos fuentes de error. De los métodos existentes para la localización y valoración de colina, colamina y serina por precipitación de sales insolubles, colorimétricos etc, se deduce que los cromatográficos, desarrollados en los últimos años, son los más rápidos, convenientes y precisos para el análisis de microcantidades de estas sustancias. Se aplicaron a los hidrolizados de germen de trigo y lecitina de soya, técnicas cromatográficas sobre papel, descriptas para el caso de constituyentes de fosfolípidos cerebrales. (Levine, Chargaff y Green: J. Biol Chem 175, 67 (1948)). Se ha desarrollado un mismo cromatograma para la localizacion de colamina y serina y otro aparte para colina; en todos los casos el papel usado fue Sleicher Schull N° 597. Se cortaron rectángulos de papel de 50 cm de altura y ancho variable según las muestras a desarrollar y a 2,2 cm del borde inferior se colocaban gotas de 0,01 cc con una pipeta capilar calibrada y suficientemente separadas y se sometían a cromatografía unidimensional durante 18 hrs en cámaras de vidrio herméticamente aisladas y saturadas previamente con el solvente a usar. Los solventes usados fueron: a) n-BuOH - Morfolina (3:1); b) n-BuOH - Piridina (4:1); c) n-BuOH - Dioxano (4:1) y n- BuOH - Agua - Amoníaco (50:7:3). La técnica de revelado era común para colamina y serina; los papeles se secaban al aire (solvente a) ó a 90° (solventes b, c y d) durante 30 a 60 minutos; luego se pulverizaban con solución de ninhidrina al 0,1% en n-BuOH y luego de 5-10 minutos de calentamiento en estufa a 90°C, se desarrollaba el color rosado de las zonas ocupadas por estas sustancias. Para localizar colina, se secaban los papeles al aires y luego en estufa, se pulverizaban con solución acuosa de ác. fosfomolíbdico al 2% y se lavaban en inmersión en n-BuOH y luego en agua. Finalmente se sumergían en solución recién preparada de Cl2Sn al 0,4% en ClH 3N y de este modo las manchas amarillas tenues de fosfmolibdato de colina, se transformaban en manchas azules bien definidas, de azul de molibdeno. Estas manchas cumplen la Ley de Beer y se aprovechó esta circunstancia para su determinación cuantitativa, por medición de la intensidad del color de las mismas con un densitómetro se medían las áreas correspondientes con un planimetro y el contenido de colina se hallaba mediante un cálculo simple. Para la determinación cuantitativa de colamina y serina, se usó la técnica de Naftalin: Nature 161, 763 (1948). Se localizaban las manchas con solución al 0,05% de ninhidrina en n-BuOH y se recortaban dejando un margen. Se colocaban en tubos de ensayo y se trataban con solución bufferizada de ninhidrina al 5% en n-BuOH y se colocaban en baño de agua para desarrollar el color violáceo, estable aproximadamente 12 hrs. Las intensidades de color se leían en un espectrofotómetro previamente calibrado y a 650 mu. En todos los casos se operó al mismo tiempo con el hidrolizado de lecitina de soya. Los valores obtenidos para estas 3 sustancias, coinciden, dentro de ciertos márgenes, con los hallados en la literatura. (ver tabla de valores en los tesis). CONCLUSIONES 1) Se ha encontrado que la cantidad de fosfolípidos totales obtenida con el método de valoración de P, está de acuerdo con la hallada en la literatura para esta tipo de material. 2) Dada la pequeñísima proporción en que se hallan la colina, colamina y serina en los vegetales, se aplicaron técnicas cromatográficas sobre papel para su caracterización, separación y determinación cuantitativa, las que han sido ampliamente desarrolladas para el caso de componentes de fosfolípidos de cerebro. 3) Se ensayó el uso de diversos solventes: n-BuOH - Morfolina (3:1); nBuOH-Dioxano(4:1) (b)nBuOH-Piridina(4:1) (c) y nBuOH-NH3-H2O (50:3:7) (d) determinándose los Rf correspondientes a las tres sustancias, previo ajuste de las técnicas mediante el uso de sustancias puras. 4) La serina y colamina se revelaron en un mismo cromatograma y la de colina en cromatograma aparte, usando las mismas técnicas que en el caso de fosfolípidos cerebrales. 5) La localización de serina y colamina, desarrolladas con solvente (c), se hizo además mediante el uso de luz ultravioleta, de acuerdo a la técnica de Philips. 6) Se eligió para cada sustancia el solvente con el que se obtenían manchas más nítidas y se ensayó en ellos la "Cromatografía cuantitativa". Se determinó además en cada caso, el límite de concentración de sustancia necesario para su identificación cromatográfica y el rango preferido para la misma. La Colina se valoró por densitometría del color azul obtenido reduciendo las manchas de fosfomolibdato de colina con Cl2Sn en el papel. Los valores obtenidos son: (ver tabla de valores en la tesis). Las determinaciones efectuadas con colina pura empleando el mismo método, indican que dicho método da valores correctos. 7) La valoración de Colamina y Serina se realizó usando técnicas combinadas de cromatografía en papel con métodos cuantitativos standrad. Encontramos que el solvente (b) es el que daba los mejores resultados por la diferencia de valores de los Rf. 8) La aplicación del método de Naftalin (93) de elución de las manchas de la reacción con la ninhidrina y su medición con el espectrofotómetro, para aminoácidos, dió muy buenos resultados con Serina y se encontró que es también aplicable, con ligeras modificaciones, en el caso de la Colamina, hallándolo válido dentro de un amplio margen de concentraciones de la misma. 9) En todas las etapas del trabajo, se realizaron simultáneamente las mismas determinaciones sobre una muestra de Lecitina de soya comercial, como control y guía, dado su reconocido contenido en Colina, Colamina y Serina. 10) Los valores obtenidos con la aplicación por vez primera de las técnicas descriptas a este tipo de material, son del orden de las halladas por otros autores con los métodos comunes de la Química analítica cuantitativa, solo que con la aplicación existosa de la cromatografía, disponemos de un método rápido, elegante y relativamente sencillo para la determinación de Colina, Colamina y Serina en cereales, que de otro modo sería largo y tedioso dada la complejidad del material.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1957 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1957
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