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Detección, localización y análisis de eventos singulares de reconocimiento molecular mediante microscopías avanzadas
Catalina von Bilderling Lía I. Pietrasanta Andrea V. Bragas
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Las células pueden ser concebidas como dispositivos capaces de procesar información bioquímica, cuya respuesta al entorno depende del estado funcional de proteínas organizadas espacialmente en una compleja red. Entender la función celular integrando la actividad molecular con la organización espacial representa un gran desafío para la biología moderna. Las fuerzas mecánicas tienen un papel importante en la organización, crecimiento, maduración y función de los tejidos. A nivel celular la transmisión de las fuerzas externas, a través de las adhesiones focales (FAs) y uniones adherentes, parece controlar la maduración o el ensamblado de estas adhesiones e iniciar las cascadas de señalización. En respuesta a las fuerzas aplicadas externamente, las células reacondicionan activamente la organización y la actividad contráctil del citoesqueleto y redistribuyen sus fuerzas intracelulares. Con el objetivo de estudiar la regulación dinámica de los contactos adhesivos y la arquitectura del citoesqueleto de la célula así como su influencia en la señalización celular, en este trabajo de Tesis se estudió la relación entre una fuerza (local o global) aplicada a la célula y el ensamblado, mecánica y dinámica de las adhesiones focales. El objetivo principal de este trabajo fue estudiar la respuesta dinámica de las proteínas de las FAs ante un estímulo mecánico controlado. En este contexto, se implementaron y desarrollaron técnicas de Microscopía de Fluorescencia, Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) y Espectroscopía de Fuerza (FS) aplicadas a distintos sistemas biomoleculares, desde plataformas biomiméticas hasta células vivas. Se optimizaron las mediciones de fuerza a nivel intermolecular y se investigaron la dinámica de las proteínas y las interacciones proteína-proteína en las FA de células vivas. Se implementó la FS mediante el estudio de las fuerzas de interacción entre grupos funcionales químicos y el sistema modelo ligando-receptor, biotina-estreptavidina. Se logró caracterizar la fuerza de interacción a nivel de moléculas individuales entre el sitio de unión RGD de la fibronectina y su receptor, la proteína integrina, en la membrana de células HC11 in vivo. Se obtuvo una fuerza característica de ruptura del complejo RGD-integrina de (37.6 ± 0.7) pN. Se expresaron las proteínas de las FAs zixina, vinculina, FAK, paxilina, integrina y actina unidas a proteínas fluorescentes visibles (VFPs) en células epiteliales mamarias de ratón HC11. Se diseñó y construyó un dispositivo estirador de células, para explorar la relación entre un estímulo mecánico global y los cambios en la dinámica y en las interacciones entre las proteínas. Mediante técnicas de microscopía de fluorescencia como FRAP (Recuperación de la Fluorescencia luego del Fotoblanqueo), FRET (Transferencia de Energía Resonante de Förster) y N&B (Número y Brillo), se estudió el estado mecánico general de las FAs, determinando la tasa de disociación de las proteínas a las FAs (koff) y el estado de agregación de las mismas. Se trabajó en la adaptación de un microscopio combinado AFM/ Fluorescencia desarrollado en el Laboratorio de Electrónica Cuántica (FCEN-UBA) para su utilización en condiciones fisiológicas y con células vivas. Se demostró que dicho microscopio es capaz de obtener imágenes combinadas en condiciones fisiológicas, con alta calidad óptica y con un rango vertical para AFM que permite que la visualización de células in vivo sea de rutina. Mediante la medición de las fuerzas de interacción entre el par ligando-receptor biotina-estreptavidina, se corroboró que el microscopio combinado alcanza la resolución requerida para cuantificar fuerzas de interacción entre moléculas individuales. Utilizando este nuevo microscopio combinado, se estudió mediante fluorescencia la evolución temporal de las proteínas de las FAs, zixina y vinculina, en respuesta a un estímulo mecánico local aplicado por AFM con un sensor de fuerza funcionalizado. Se observó el remodelado de las FAs maduras y el reclutamiento de la proteína vinculina para la formación de nuevas FAs en respuesta a la fuerza local aplicada. En este contexto, se presenta una estrategia novedosa que permite obtener imágenes de alta resolución y medir fuerzas al nivel de moléculas individuales en tiempo real. Nuestra estrategia combina metodologías de alta resolución para sensar y caracterizar cambios físicos/bioquímicos en células vivas. En conclusión, se implementaron técnicas de AFM y fluorescencia para estudiar algunos aspectos de la compleja maquinaria celular. De la correlación directa de estas técnicas en el nuevo microscopio combinado estaríamos en condiciones de abordar nuevos desafíos fundamentales en el entendimiento de la biofísica y la biología celular.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
No disponibles.
Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 2013 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
2013
Información sobre licencias CC