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Título de Acceso Abierto

Clonado, organización genómica y expresión de la glutamato dehidrogenasa NADP dependiente (GluDH-NADP) de Trypanosoma Cruzi

Patricia Alejandra Barderi Juan José Cazzulo

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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital

Epimastigotes de Trypanosoma cruzi, el protozoo parásito que causa la enfermedad de Chagas, contienen dos glutamato dehidrogenasas diferentes (GluDHs), NAD y NADP dependientes. En este sentido los parásitos se asemejan a las bacterias, hongos y plantas y se diferencian de animales superiores que poseen sólo una enzima inespecífica para coenzima. La GluDH-NADP dependiente (EC 1.4.1.4) es un hexámero formado por subunidades idénticas de 47kDa, mostrando ser muy semejante a la correspondiente enzima de E. coli en cuanto a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal. La forma NADP dependiente podría ser biosintética mientras la forma NAD dependiente podría tener un rol catabólico. La GluDH-NADP dependiente fue purificada a homogeneidad proteica a partir de epimastigotes de Trypanosoma cruzi mediante un protocolo mejorado que incluye cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. Se determinó la secuencia de aminoácidos de 11 péptidos internos, obtenidos por digestión con BrCN, tripsina, endopeptidasa Arg-C o endopeptidasa Lys-C. Dichas secuencias, correspondientes aproximadamente al 30% de la molécula, mostraron una identidad del 74% con la enzima similar de E. coli. Utilizando un suero policlonal monoespecífico producido contra la proteína purificada se realizó el rastreo de una biblioteca de expresión genómica de T. cruzi en el vector λgt11. De esta forma pudo seleccionarse un único clon conteniendo 270 pb correspondientes al extremo 3' del gen que fue secuenciado completamente. Reacciones de PCR usando iniciadores construídos de acuerdo a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la enzima madura y con la secuencia del clon correspondiente al extremo C-terminal pudieron clonarse y secuenciarse dos ORFs completos (TcGluDH1 y TcGluDH2). Las secuencias obtenidas muestran mayor homología con la enzima de Escherichia coli (70-72% de identidad), y menor homologia (52-57%)con la correspondiente enzima de eucariontes inferiores. A partir de la secuencia de ADN se predijo una proteína que contiene 446 aminoácidos. Usando el gen TcGluDH1 como sonda se realizaron experimentos de Southern blot, usando fragmentos de restricción o cromosomas enteros separados por electroforesis en campo pulsado, indicando variaciones entre los diferentes clones y cepas de parásitos, sugiriendo la presencia de varios genes codificando para la GluDH-NADP. La expresión de la enzima resultó ser diferente en los distintos estadíos del desarrollo. La forma epimastigote presenta mayor cantidad de ARNm y proteína (a juzgar por la actividad enzimática y ensayos de Western blot), en comparación con otras formas del parásito. El gen clonado TcGluDH1 fue expresado en E. coli, produciendo una enzima recombinante activa con constantes cinéticas similares a la enzima natural. A pesar de que las evidencias bioquímicas sugieren que la enzima se localiza tanto en el citoplasma como en la mitocondria, nuestros resultados indican una localización exclusivamente citosólica para la GluDH-NADP.

Palabras clave – provistas por el repositorio digital

TRYPANOSOMA CRUZI; GLUTAMATO DEHIDROGENASA NADPH DEPENDIENTE; CATABOLISMO DE AMINOACIDOS; PURIFICACION; SECUENCIACION DE ADN; COMPARACION DE SECUENCIAS; SECUENCIACION DE PROTEINAS; NADP-LINKED GLUTAMATE DEHYDROGENASE; AMINO ACID CATABOLISM; PURIFICATION; DNA SEQUENCING; SEQUENCE COMPARISION; PROTEIN SEQUENCING