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Título de Acceso Abierto

Purificación y estudio de las características estructurales, cinéticas y regulatorias de la pep-carboxiquinasa del Trypanosoma cruzi

Cora Beatriz Cymeryng Joaquín Juan Bautista Cannata

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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
l) Se purificó a homogeneidad la PEPCK del T.cruzi utilizando el siguiente procedimiento: a) ruptura de las células por tratamiento con ultrasonido. b) precipitación fraccionada con (NH4)2SO4. c) cromatografía en columna de Sephadex G-200. d) DEAE-celulosa. e) Hidroxilapatita. f) ATP-agarosa. El criterio de pureza utilizado fue la presencia de una única banda en las electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones disociantes. La purificación lograda fue de 488 veces con un rendimiento del 7.2 %. 2) El análisis de la composición de aminoácidos indicó una alta proporción de medias cisteínas y una relativamente baja de prolina en comparación con los valores obtenidos con enzimas de otros origenes. El volumen parcial específico, calculado a partir de la composición de aminoácidos fue de 0.730 cm3/g. 3) Se calcularon los parámetros hidrodinámicos y moleculares de la enzima por filtración en geles, ultracentrifugación en gradientes de sacarosa, electroforesis en condiciones disociantes y cromatoenfocado obteniéndose los siguientes valores: coeficiente de sedimentación, S20,w= 6.7 10^(-13) seg; coeficiente de difusión libre, D20,w=4.9 10^(-7) cm2seg^(-1); radio de Stokes, a= 44.56 Å y punto isoeléctrico de 7.3. El peso molecular de la enzima nativa, calculado utilizando la ecuación de Svedberg, fue de 123.000 Da, lo que coincide con el resultado obtenido con el Método de Andrews. El peso molecular de la subunidad fue de 61 kDa por lo que la enzima sería un dímero. El cociente friccional de la enzima fue de 1.36 lo que indicaría una estructura levemente asimétrica. 4) Se determinó el pH óptimo para las tres reacciones catalizadas por la enzima: carboxilación [6.55], formación de PEP [7.76] e intercambio [6.48], encontrándose que la enzima es más activa en la dirección de formación de PEP. 5) La especificidad hacia los nucleótidos varió según la reacción considerada. En las reacciones de intercambio y de formación de PEP si bien la enzima mostró actividad en todos los casos esta fue mayor con los nucleótidos púricos. En el caso de la reacción de carboxilación la enzima presentó una especificidad absoluta por ADP. No se observó inhibición significativa cuando se ensayaron los distintos nucleótidos en las reacciones de carboxilación y de formación de PEP cuando el sustrato era el nucleótido de adenina. Sin embargo, cuando el GTP era el sustrato para la reacción de formación de PEP, todos los nucleótidos presentaron un efecto inhibitorio importante. En el caso de la reacción de intercambio tanto con ATP como con GTP como sustratos la inhibición fue mayor con los nucleótidos pirimidínicos y con el nucleótido de inosina que con los de adenina y guanina. Por otra parte ni el IDP ni el ITP ejercieron efecto inhibitorio significativo sobre la reacción de carboxilación (sustrato: ADP)o la reacción de formación de PEP (sustrato: ATP) respectivamente. 6) A1 igual que la enzima aislada de otras fuentes la PEPCK presentó un requerimiento absoluto por metal divalente. En este sentido el Mn^(2)+ fue el más efectivo siguiéndole en importancia el Cd^(2)+, aunque en ese caso la concentración de metal requerida para lograr la mayor activación fue significativamente menor. La enzima presentó una cinética michaeliana al ensayarla en presencia de Mn^(2)+, Cd^(2)+ y Mg^(2)+. Tanto el Cd^(2)+ como el Mg^(2)+ ejercieron un efecto sinérgico con el Mn^(2)+ siendo los gráficos de dobles recíprocos bifásicos en ambos casos. 7) Se determinaron los parámetros cinéticos para las tres reacciones: a) Carboxilación: Km PEP= 35 uM; Km ADP-Mn= 16 uM y Km NaHCO3= 2.6 mM, Vmax= 3.2 umoles/min/mg. b) Formación de PEP: Km0A= 49 uM, KmATP-Mn= 27 uM, Vmax=31.7 umoles/min/mg. c) Intercambio: S0.5 0A : 41 uM (ATP), 41 uM (GTP) con nH= 1.6 y Km ATP-Mn= 37 uM, Vmax= 0.97 umoles/min/mg. 8) Se estudió también el efecto histerético de activación de la enzima en la mezcla de reacción durante la determinación de la actividad de carboxilación encontrándose una relación entre dicho efecto y la concentración proteica de la muestra enzimática estudiada. El efecto de histéresis desaparecia cuando la enzima se sometía a diálisis pero se recuperaba por el agregado de sales a la mezcla de reacción, siendo en ese sentido el (NH4)2SO4 el más efectivo. 9) El quinolinato, catabolito del triptofano e intermediario en la síntesis de NAD+ fue un inhibidor tanto de la actividad de intercambio como de la de carboxilación de la PEPCK aislada del T. cruzi. 10) Se estudió también el efecto de inhibidores de enzimas con grupos tioles encontrándose que la enzima es muy sensible al efecto de los mercuriales orgánicos (CMS, FMA y PCMB)y también se inhibe significativamente en presencia de O-Iodosobenzoato, NEM, Iodoacetamida y DTNB. La reversión de la inhibición con DTT indicó que esta última se debía a un efecto de los reactivos sobre los grupos tioles. ll) No se encontraron distintas formas moleculares de la enzima utilizando la cromatografía líquida rápida para proteínas. Tampoco pudieron encontrarse productos de menor tamaño provenientes del tratamiento de la enzima altamente purificada con la proteinasa cuantitativamente más importante del T.cruzi. 12) Se estudió también una actividad oxaloacético decarboxilásica asociada a la PEPCK y que posiblemente sea intrínseca de la enzima. Dicha actividad no fue modificada significativamente por los nucleósidos difosfato. Con respecto al efecto de los metales se observó una activación en presencia de Cd^(2)+ y de Mn^(2)+ pero sólo cuando la concentración de los metales era menor de 50 uM. 13) Se puso de manifiesto la presencia en epimastigotes de T. cruzi de una actividad oxaloacético decarboxilásica independiente de la PEPCK y altamente activable por Cd^(2)+. Dicha actividad se encontró en mayor proporción en extractos provenientes del tratamiento de las células por congelamiento y descongelamiento permaneciendo la mayor proporción de la actividad carboxiquinásica en el sedimento de dicho tratamiento. La cromatografía en ATP-agarosa de dicho extracto permitió una separación parcial de ambas actividades (carboxiquinásica y oxaloacético decarboxilásica dependiente de Cd^(2)+). La curva de pH para el extracto proveniente del tratamiento por congelamiento y descongelamiento mostró dos máximos para la actividad 0D (Cd2+) [5.4 y 6.65] y uno para la actividad OD en ausencia de metal [5.4].
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