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Inhibidores fisiológicos de la H+-ATPasa mitocondrial de tripanosomatideos
María Cristina Rilo Andrés Oscar Manuel Stoppani
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
En el presente trabajo de tesis se realizó el estudio de inhibidores fisiológicos y farmacológicos de la H+-ATPasa mitocondrial de tripanosomatídeos, con el fin de esclarecer el mecanismo de acción de la enzima de parásito, aportando mayores evidencias que permitan establecer posibles diferencias y similitudes con la enzima de mamífero. 1.- Se aisló y estudió el inhibidor peptidico (IF1) de la H+—ATPasdae T.cruzi y C.fasciculata. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: a) Las partículas submitocondriales de T.cruzi y C.fasciculata filtradas a través de una columna de Sephadex G-50, aumentaron su actividad 3-4 veces, debido a la separación del IF1 de la enzima. El inhibidor de T.cruzi retenido en la columna de Sephadex G-50, se recuperó por aumento de la fuerza iónica del buffer en presencia de DTT y EDTA. b) Para la obtención de IF1 de la H+—ATPasade fracción mitocondrial de T.cruzi y C.fasciculata se procedió según el siguiente esquemade trabajo: I.- ruptura mecánica de las células con perlas de vidrio. II.- centrifugación diferencial para la obtención de fracción mitocondrial. III.— sonicación en buffer pirofosfato para la obtención de partículas submitocondriales. IV.- tratamiento con colato y precipitación fraccionada con (NH4)2SO4 para la obtención de la H+-ATPasa. V.- calentamiento y precipitación alcohólica con el fin de aislar al inhibidor proteico. c) La actividad del inhibidor se puso de manifiesto cuando se incubaron particulas activadas en presencia de IFl, en un volumen reducido para evitar la disociación y con el agregado de ATP-Mg para generar un estado conformacional transitorio de la enzima que permita la formación del complejo enzima-inhibidor. d) Los estudios de inhibición realizados determinaron la posibilidad de establecer interacciones entre la H+-ATPasa y el inhibidor de un mismo origen (interacciones homólogas), como asi también entre la enzima e inhibidor de distintos orígenes (interacciones heterólogas). Esto evidencia la existencia de importantes analogías entre las H+-ATPasas y los inhibidores proteicos de distintas especies. e) Se observó inhibición de la fracción soluble de la enzima (F1-ATPasa) de T.cruzi indicando que no seria necesaria la presencia de los componentes de membrana para que IF1 interactúa con la subunidad catalitica. f) El inhibidor de C.fasciculata resultó ser sensible a la inactivación por tripsina, similar a lo observado para el inhibidor de higado de rata y de corazón bovino. g) Por filtración del inhibidor proteico a través de una columna de HPLC-C18 con gradiente de acetonitrilo, se obtuvo un pico máximoa 35% de acetonitrilo que presentó actividad de inhibidor. Dicho valor de gradiente se asemeja al de elución de IF1 de corazón bovino y de C.utilis. h) El peso molecular calculado para IF1 de C.fasciculata por electroforesis en gel de poliacrilamida al 10 y 15% en presencia de SDS fue 8000-8500 ± 1500. Dicho valor se corresponde a los publicados para IF1 de otros organismos. Los datos obtenidos demuestran que las caracteristicas del inhibidor proteico de T.cruzi y C.fasciculata son similares a las descriptas para otros inhibidores. 2) Se demostró la regulación de la cadena respiratoria y la H+-ATPasa mitocondrial de T.cruzi y C.fasciculata por poliaminas. Los resultados se describen a continuación: a) Las fracciones mitocondriales de C.fasciculata aisladas en presencia de putrescina, espermidina y espermina presentaron mayor velocidad de consumo de oxigeno y disminución de la actividad de hidrólisis de ATP. b) En partículas submitocondriales de T.cruzi y C.fasciculata se observó inhibición de la H+-ATPasa por incubación con espermina, efecto posiblemente atribuido a la formación del complejo ATP-espermina, debido a que la inhibición por espermina se revierte con el aumento de la concentración de Mg2+ en el medio de reacción. c) La cinética de inhibición de la H+-ATPasade partículas submitocondriales de T.cruzi incubadas con espermina fue de tipo no competitivo. La fracción soluble Fl-ATPasa de T.cruzi no presentó inhibición. La inactivación por espermina de la H+—ATPasa de particulas submitocondriales de C.fasciculata fue de tipo competitivo y mixto, observándose aumento del Km y disminución de la Vmax. En la fracción F1-ATPasa de la enzima de C.fasciculata se observó inhibición de tipo competitivo. d) Las células de T.cruzi cultivadas en ausencia de poliaminas, presentaron una marcada activación de la enzima H+-ATPasa. Los presentes datos indican que las poliaminas intervienen en los procesos de regulación de los niveles de energia intracelulares de los tripanosomatideos similar a lo observado para células de mamíferos. 3) Se estudió la actividad de la H+-ATPasa de C.fasciculata y L.seymouri en presencia de drogas. Los resultados obtenidos muestran que: a) El crecimiento de C.fasciculata y L.seymouri fue inhibido por el agregado al medio de cultivo del nitrofurano nifurtimox y de la naftoquinona CG 8-935. b) La actividad de la H+—ATPasade fracción mitocondrial obtenida de C.fasciculata y de L.seymouri cultivadas con el agregado de droga al medio no presentó modificación. c) La incubación de partículas submitocondriales con el nitrofurano nifurtimox y con la naftoquinona CG 8-935 directamente en el medio de medida, produjo la inhibición de la actividad de la H+-ATPasa de C. fasciculata, de L.seymouri y de T.cruzi. d) La incubación de la fracción mitocondrial de C.fasciculata y de L.seymouri con el sistema generador de oxi-radicales xantina-xantina oxidasa no produjo inhibición de la H+-ATPasa a diferencia de lo observado con T.cruzi. e) La presencia de grupos -SH en la enzima H+-ATPasa de C.fasciculata y L.seymouri se puso de manifiesto incubando la fracción mitocondrial con reactivos específicos para grupos sulfhidrilos (NEM, CMB y FMA). Los resultados demostraron que los grupos -SH de la enzima de C.fasciculata se encuentran menos expuestos a dichos reactivos que en la enzima de L.seymouri. En ambos casos el FMA fue el inhibidor más efectivo, seguido por CMB y NEM.Estos datos concuerdan con lo observado para la enzima de T.cruzi. Los datos obtenidos sugieren sutiles diferencias entre las enzimas de C.fasciculata y L.seymouri, mientras que dichas diferencias se acentúan aún más al compararse con la enzima de T.cruzi.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1993 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1993
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