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En este trabajo se estudiaron distintos aspectos a nivel molecular del mecanismo catalítico de la nitrito reductasa de cobre (NirK), una enzima que cataliza la reducción de nitrito (NO2-) a óxido nítrico (NO) en la desnitrificación. Estas enzimas se clasifican de acuerdo a sus propiedades espectroscópicas en verdes y azules. El trabajo se desarrolló a partir del estudio de dos NirK producidas de manera recombinante, una verde obtenida del microorganismo Sinorhizobium meliloti 2011 (SmNirK), y otra azul obtenida de Bradyrhizobium japonicum USDA 110 (BjNirK). Los dos microorganismos son bacterias desnitrificantes de importancia económica para la región por su uso en la formulación de bioinoculantes. Ambas NirK presentan una estructura homotrimérica con dos sitios de cobre por monómero denominados T1Cu y T2Cu, en línea con la mayoría de las NirK caracterizadas. El centro T1Cu, el cual le confiere el color característico a la enzima, es un centro de transferencia electrónica (TE). El T2Cu es el sitio activo en donde ocurre la unión y reducción del sustrato. Las NirK requieren de un dador electrónico fisiológico para llevar a cabo la catálisis, los cuales también fueron producidos de manera recombinante y caracterizados. El dador electrónico fisiológico de la SmNirK es una proteína de cobre mononuclear denominada pseudoazurina (SmPaz), mientras que para BjNirK es un citocromo c (BjCitc550). El mecanismo catalítico de las NirK puede ser dividido en líneas generales en tres procesos. El primer proceso de TE resulta de la interacción de la NirK con el dador electrónico fisiológico. Esto implica la transferencia de un electrón desde el dador electrónico reducido al T1Cu de la NirK (TE interproteína). El segundo proceso de TE ocurre desde el T1Cu reducido al sitio activo T2Cu (TE intraproteína), lo que permite la reducción del sustrato (NO2-) unido al sitio y liberación del producto (NO) (tercer proceso). El proceso de TE intraproteína ocurre a través del puente estructural Cis-His que conecta los dos sitios de Cu en las NirK. En este puente coexisten dos vías estructurales que potencialmente pueden actuar como camino de TE. Una de estas vías involucra el camino covalente Cis-His, mientras que la segunda vía involucraría un camino mixto formado por enlaces covalentes y el puente de hidrógeno establecido entre el O del carbonilo de la Cis y el Nδ1 del imidazol de la His (Nδ1H...O=C). Sobre la base de estudios computacionales se ha propuesto que las NirK azules utilizarían la primer vía mientas que las verdes utilizarían la segunda. La determinación de los potenciales formales de reducción (E0’) de los centros de cobre de la forma as-purified de SmNirK mediante titulaciones potenciométricas permitió concluir que, en línea con la mayoría de las NirK, E0’ T1Cu > E0’ T2Cu. Estos valores definen un proceso de TE T1Cu→T2Cu termodinámicamente desfavorable en la enzima. Los resultados obtenidos a partir de ensayos de EPR sugieren que los valores relativos de los E0’ se invierten como consecuencia de la interacción SmPaz/SmNirK en presencia de sustrato favoreciendo el proceso de TE. La TE intraproteína en esta enzima también fue estudiado cambiando los aminoácidos del puente Cis-His mediante mutagénesis sitio dirigida. Las variantes obtenidas resultaron inactivas frente a SmPaz. Modelos estructurales obtenidos mediante estudios computacionales del tipo QM/MM, junto con los resultados experimentales, sugirieren que la falta de actividad se debería a una interrupción de la TE intraproteína, posiblemente por la ausencia del puente de hidrógeno Nδ1H...O=C.Los resultados obtenidos para las variantes de SmNirK derivaron en el estudio de la relevancia de la estructura Nδ1H...O=C en la TE intraproteína de las NirK verdes y azules y en la dependencia de la actividad catalítica de las NirK con el pH del medio. Esto fue realizado mediante estudios dependientes del pH en las dos NirK en los cuales se monitorearon los estados de oxidación de los dos centros mediante espectroscopía UV-vis y EPR luego de varios ciclos redox de la enzima en condiciones catalíticas. Los resultados más importantes de estos estudios mostraron que a pH 10, condición en la cual las NirK se vuelven inactivas, el T2Cu mantiene la capacidad de unir y reducir el sustrato aunque a una tasa no detectable por los ensayos cinéticos utilizados. Esto se atribuye a que el alto pH produce el desacople entre el proceso de TE intraproteina y del proceso de unión nitrito-T2Cu, lo cual se originaría por la ruptura del puente Nδ1H...O=C. Otro de los resultados relevantes es que en las dos NirK el puente Nδ1H...O=C se comportaría como el único camino de TE, lo que implicaría que la estructura electrónicas del T1Cu no determina el camino de TE.

Epimastigotes de Trypanosoma cruzi, el protozoo parásito que causa la enfermedad de Chagas, contienen dos glutamato dehidrogenasas diferentes (GluDHs), NAD y NADP dependientes. En este sentido los parásitos se asemejan a las bacterias, hongos y plantas y se diferencian de animales superiores que poseen sólo una enzima inespecífica para coenzima. La GluDH-NADP dependiente (EC 1.4.1.4) es un hexámero formado por subunidades idénticas de 47kDa, mostrando ser muy semejante a la correspondiente enzima de E. coli en cuanto a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal. La forma NADP dependiente podría ser biosintética mientras la forma NAD dependiente podría tener un rol catabólico. La GluDH-NADP dependiente fue purificada a homogeneidad proteica a partir de epimastigotes de Trypanosoma cruzi mediante un protocolo mejorado que incluye cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. Se determinó la secuencia de aminoácidos de 11 péptidos internos, obtenidos por digestión con BrCN, tripsina, endopeptidasa Arg-C o endopeptidasa Lys-C. Dichas secuencias, correspondientes aproximadamente al 30% de la molécula, mostraron una identidad del 74% con la enzima similar de E. coli. Utilizando un suero policlonal monoespecífico producido contra la proteína purificada se realizó el rastreo de una biblioteca de expresión genómica de T. cruzi en el vector λgt11. De esta forma pudo seleccionarse un único clon conteniendo 270 pb correspondientes al extremo 3' del gen que fue secuenciado completamente. Reacciones de PCR usando iniciadores construídos de acuerdo a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la enzima madura y con la secuencia del clon correspondiente al extremo C-terminal pudieron clonarse y secuenciarse dos ORFs completos (TcGluDH1 y TcGluDH2). Las secuencias obtenidas muestran mayor homología con la enzima de Escherichia coli (70-72% de identidad), y menor homologia (52-57%)con la correspondiente enzima de eucariontes inferiores. A partir de la secuencia de ADN se predijo una proteína que contiene 446 aminoácidos. Usando el gen TcGluDH1 como sonda se realizaron experimentos de Southern blot, usando fragmentos de restricción o cromosomas enteros separados por electroforesis en campo pulsado, indicando variaciones entre los diferentes clones y cepas de parásitos, sugiriendo la presencia de varios genes codificando para la GluDH-NADP. La expresión de la enzima resultó ser diferente en los distintos estadíos del desarrollo. La forma epimastigote presenta mayor cantidad de ARNm y proteína (a juzgar por la actividad enzimática y ensayos de Western blot), en comparación con otras formas del parásito. El gen clonado TcGluDH1 fue expresado en E. coli, produciendo una enzima recombinante activa con constantes cinéticas similares a la enzima natural. A pesar de que las evidencias bioquímicas sugieren que la enzima se localiza tanto en el citoplasma como en la mitocondria, nuestros resultados indican una localización exclusivamente citosólica para la GluDH-NADP.