Catálogo de publicaciones

Fil:Baldessari, Alicia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Moreno, Silvia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Muy poco es conocido acerca de la biosíntesis de bufadienólidos de sapo: el resultado más significativo es que el colesterol resulta un adecuado precursor biosintético de los mismos. A partir de ahí se deben descubrir todos los intermediarios de la secuencia biosintética, investigando el posible rol como precursores de compuestos esteroidales que resulten de una modificación adecuada del colesterol en el camino a bufadienólidos. Puesto que el colesterol marcado con 14C en C-20 resultaba incorporado en los bufadienólidos del veneno de sapos y el mismo compuesto marcado en C-24 no se incorporaba, era muy probable que la cadena lateral de colesterol se escindiera entre C-20 y C-22 durante el proceso biosintético. Partiendo de esa premisa, en el presente trabajo se decidió realizar la síntesis de compuestos esteroidales marcados en C-20 o en C-21, que estuvieran estructuralmente más relacionados con los bufadienólidos que el colesterol. Se sintetizaron: |20-14C|3β-hidroxi-5β-pregnan-20-ona, el mismo compuesto pero marcado con 14C en C-21 y |21-14C|5β-colestan-3β-ol (coprostanol 21-14C). Estos tres compuestos fueron inoculados a sapos intactos con el objeto de verificar si producíanbufaienólidos radiactivos. El coprostanol radiactivo resultó incorporado en el bufadienólido arenobufagina, mientras que los otros dos compuestos produjeron veneno inactivo. Se inoculó en forma paralela coleterol tritiado, como control del ensayo. También se inoculó ácido |2-14C| mevalónico, comprabándose la formación de "γ- sitosterol" radiactivo, mezcla de esteroles (colesterol, campesterol, estigmasterol y sitosterol) que se separó en sus componentes, para verificar que el único esterol radiactivo (o sea biosintetizado a partir del ácido mavalónico marcado) era el colesterol y que los demás (esteroles típicos de vegetales) no resultaban marcados. Con el objeto de conocer el origen biosintéticos del colesterol en las glándulas productoras del veneno se hicieron ensayos con homogeneizados y con cortes de tejido de glándula parotide. Se incubaron cortes de tejido de glándula parotide y de hígado de sapos con |1-14C| acetato de sodio y con |5-3H| mevalonolactona, observándose que en las condiciones experimentales empleadas, sólo los cortes de tejido de hígado sintetizaban colesterol radiactivo. Como no se producía biosíntesis evidente de colesterol de novo en las glándulas parotides, era de esperar un aprovisonamiento de colesterol desde el exterior de las células glandulares. Por ello se aislaron las lipoproteínas de suero sanguíneo de sapos, se las marcó con 125I y se efectuaron ensayos de unión de las lipoproteínas a la membrana celular, midiéndose las constantes de disociación de los complejos lipoproteína-receptor así como las capacidades máximas de unión. De esta manera se observó la presencia de sitios de unión de alta afinidad para las lipoproteínas transportadoras de colesterol. Para evaluar la posible "internalización" de las lipoproteínas, se las marcó con linoleato de |1,2,6,7-3H| colesterol y se incubaron cortes de tejido de glándula con esas lipoproteínas, con y sin el agregado de colchicina (un inhibidor de la "internalización"). Se observó la presencia de colesterol tritiado y linoleato de colesterol tritiado dentro del tejido, por lo que se confirmó el aporte externo de colesterol.

El presente trabajo tuvo por objeto la sintesis de disacáridos parcialmente benzoilados por reacciones que no requirieran sucesivas etapas de protección y desprotección. Se encontraron las condiciones experimentales que permitieron obtener la l,2,6,2',3´,4',6'-hepta-O-benzoil-β-celobiosa y la l,2,6,2',3',4',6'-hepta—O-benzoil-β—lactosa con rendimientos satisfactorios y posibilitaron la separación de manera sencilla de la mezcla de los mismos con otros derivados benzoilados formados también durante la reacción. Por metilación e hidrólisis se demostraron las posiciones de los hidroxilos sin benzoilar en ambos compuestos. Se formulan hipótesis sobre los posibles factores que pueden influir en la formación de la l,2,6,2',3',4´,6'-hepta-O-benzoil-β-celobiosa y la l,2,6,2',3',4',6'-hepta-O-benzoil-β-lactosa. Los hepta-O-benzoilos de celobiosa y de lactosa obtenidos se sometieron a la reacción de amonólisis. En las mismas no se pudieron detectar N-benzoil-aldobiosilaminas ni 1,1-bis(benzamido)-1-desoxi-albobiitoles y en cambio se aislaron los disacóridos y sus correspondientes 6-O-benzoil derivados. Se analizó la influencia de los grupos benzoilo de diferentes posiciones en la formación de los productos nitrogenedos y se formuló una posible estructura que estabilizaria el grupo G-O-benzoilo en la 6-O-benzoil-celobiosa y en la 6-O-benzoil-lactosa. Se comprobó le estabilidad de los grupos 6-O-benzoilo de la 6-O-benzoíl-celobiosa, y 6-O-benzoil-lactosa respecto al mismo grupo en el 6-O-benzoil-celobiitol, el 6-O-benzoil-lactitol, la 6-O-benzoil-D-glucosa y el 6-O-benzoil-D-glucitol frente a la amonólisis y se postulan las posibles interacciones que darían lugar a la diferente estabilidad observada. Esta tesis se divide en los siguientes capitulos: Capitulo l. Contiene el resumen sobre las reacciones de benzoilación de monosacáridos, con especial énfasis en las condiciones de reacción y reactivos que pudieran dar alguna selectividad a esta reacción. Capitulo 2. Consiste en una revisión bibliográfica de los métodos de metilación en el campo de los hidratos de carbono, ya que aplicamos esta técnica a la demostración de la posición del hidroxilo libre en los hepta-O-benzoatos obtenidos en este trabajo. Capitulo 3. En él se agrupan los antecedentes sobre benzoilaciones de disacáridos descriptos en la literatura y se discuten dichos resultados comparativamente con los resultados obtenidos por nosotros. Capitulo 4. Se presenta la parte experimental del trabajo. Capitulo 5. Se presenta la revisión bibliográfica.

Fil:Alonso Garrido, Daniel Oscar. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En el presente trabajo de tesis doctoral se sintetizan 4 series diferentes de 5-amino-1H-1-arilpirazoles con el objetivo de buscar análogos al insecticida comercial Fipronil® para evaluar su posible actividad fitosanitaria en diferentes modelos biológicos. Para la síntesis química se procedió a la obtención y caracterización de la familia de 5-amino-1-H-1-arilpirazoles-4-carbonitrilos, la cual posteriormente se modificó por hidrólisis acida de la posición 4 del anillo pirazol a 5-amino-1H-1-arilpirazoles-4-carboxamidas. Por otro lado se realizó la síntesis de 5-amino-1H-1-aril-4-sulfinilpirazoles previa síntesis de la serie 5-amino-1H-1-arilpirazoles. Los productos de síntesis se aislaron y posteriormente caracterizaron utilizando técnicas de resonancia magnéticanuclear(RMN), espectrometría de masa, punto de fusión, cuantificados por cromatografía. Asimismo se aisló el ingrediente activo (i.a.) Fipronil® del comercial CLAP 20% por sucesivas extracciones y cromatografía en columna para luego utilizarlo como testigo en los bioensayos de actividad insecticida y fungicida. Los ensayos de actividad insecticida de pirazoles sintetizados y seleccionados, se realizaron en el lepidópteroSpodoptera frugiperda o gusano cogollero; y en el microlepidóptero Tuta absoluta o minador del tomate, encontrando actividad insecticida de interés por parte de dos de los compuestos sintetizados y seleccionados y ensayados frente a ambos modelos biológicos. Respecto la actividad fungicida en cepas de hongos fitopatógenos y una especie de hongo saprófito, se ensayaron todos los compuestos sintetizados y ninguno presentó actividad fungicida en los hongos ensayados.

En el presente trabajo de tesis doctoral se sintetizan 4 series diferentes de 5-amino-1H-1-arilpirazoles con el objetivo de buscar análogos al insecticida comercial Fipronil® para evaluar su posible actividad fitosanitaria en diferentes modelos biológicos. Para la síntesis química se procedió a la obtención y caracterización de la familia de 5-amino-1-H-1-arilpirazoles-4-carbonitrilos, la cual posteriormente se modificó por hidrólisis acida de la posición 4 del anillo pirazol a 5-amino-1H-1-arilpirazoles-4-carboxamidas. Por otro lado se realizó la síntesis de 5-amino-1H-1-aril-4-sulfinilpirazoles previa síntesis de la serie 5-amino-1H-1-arilpirazoles. Los productos de síntesis se aislaron y posteriormente caracterizaron utilizando técnicas de resonancia magnéticanuclear(RMN), espectrometría de masa, punto de fusión, cuantificados por cromatografía. Asimismo se aisló el ingrediente activo (i.a.) Fipronil® del comercial CLAP 20% por sucesivas extracciones y cromatografía en columna para luego utilizarlo como testigo en los bioensayos de actividad insecticida y fungicida. Los ensayos de actividad insecticida de pirazoles sintetizados y seleccionados, se realizaron en el lepidópteroSpodoptera frugiperda o gusano cogollero; y en el microlepidóptero Tuta absoluta o minador del tomate, encontrando actividad insecticida de interés por parte de dos de los compuestos sintetizados y seleccionados y ensayados frente a ambos modelos biológicos. Respecto la actividad fungicida en cepas de hongos fitopatógenos y una especie de hongo saprófito, se ensayaron todos los compuestos sintetizados y ninguno presentó actividad fungicida en los hongos ensayados.

n esta tesis se describe la síntesis de análogos de esteroides neuroactivos por dos vías: i) adición de nitreno a dobles enlaces en C-2/C-3 y C-5/C-6 a partir de un sulfamato en posición 19, ii) síntesis estereoselectiva de 5αH-6tiapregnanos. Se desarrollo la metodología de aziridinación intramolecular, a partir de sulfamatos olefínicos, derivados de alcoholes primarios y secundarios, posteriormente se los sometió condiciones de aziridinación intramolecular en presencia de iodosilbenceno y catálisis de complejos de Cu(II) para la obtención de aziridinas bicíclicas fusionadas. Se realizaron aperturas de las aziridinas con nucleófilos nitrogenados, oxigenados y azufrados, la apertura en todos los casos fue en el carbono más sustituido. Se realizó la segunda sustitución sobre el carbono que contenía al oxígeno mediante activación del nitrógeno del sulfamidato. Se aplicó la metodología en esteroides utilizando como primer sustrato 3β-acetiloxi-19- hidroxi-5-pregnen-20-ona, se sintetizó 3β-acetiloxi-5β,6β-iminopregnan-20-ona N,19- sultona y se realizaron aperturas de la aziridina con fluoruro, cianuro y acetato, observándose la apertura en C-5. En el caso del acetato a altas temperaturas se observó regioselectividad inversa en C-6 debido a la migración del acetato. A partir del 5β,6β- aziridinoesteroide se sintetizó el análogo de neuroesteroide 3α-hidroxi-5β,6β- iminopregnan-20-ona N,19-sultona. Se utilizó también la metodología en 19-hidroxi-2- pregnen-20-ona y se sintetizó el 2β,3β-iminopregnan-20-ona N,19-sultona, a partir del mismo se prepararon los derivados 3α-hidroxi-S,S-dioxo-19,2-(epoxitioimino)-pregnan-20- ona, N,bencil-3α-hidroxi-S,S-dioxo-19,2-(epoxitioimino)-pregnan-20-ona y 3α-fluoro-S,S- dioxo-19,2-(epoxitioimino)-pregnan-20-ona. Para la síntesis de 6-tiapregnanos se partió de la sustitución nucleofílica de un 7-yodo-5,6-seco-6-norpregnano funcionalizado en C- 19, que se obtiene por ruptura de un 5,6-diol esteroidal con HgO y yodo en presencia de luz. El esteroide anterior se sustituyó con tioacetato y luego se hidrolizó. El hemitiocetal resultante se redujo regioselectivamente por la cara α con trietilsilano, luego mediante la reacción de Mitsunobu se epimerizó a 3α y posteriormente fue convertido en 10-metilo mediante la reacción de Barton-McCombie. Por hidrólisis del benzoato se obtuvo 3α- hidroxi-6-tia-5α-pregnan-20-ona y por oxidación con oxone el sulfóxido y la sulfona.

Mycobacterium tuberculosis es un patógeno humano que causa más de un millón de muertes anuales, siendo el agente infeccioso bacteriano más letal. El surgimiento de cepas multi resistentes y extremadamente resistentes de M. tuberculosis, prácticamente intratables con los antibióticos que existen actualmente, ha generado la necesidad de contar con nuevas drogas para combatir esta enfermedad. Por tal motivo es necesario validar nuevos blancos de acción de drogas y estudiar los mecanismos de resistencia a las mismas. Isoxil y Tiacetazona son dos drogas que fueron utilizadas para el tratamiento de la tuberculosis y luego dejadas de lado por producir efectos adversos. Si bien se ha estudiado su acción sobre la síntesis de ácidos micólicos, ácidos grasos de cadena larga que son componentes esenciales de la envoltura celular de las micobacterias, su blanco de acción en M. tuberculosis aún se desconoce. Por lo tanto en este trabajo de tesis decidimos realizar estudios a fin de develar el/los blancos de estas drogas. Para ello se utilizó una estrategia combinada basada en lipidómica y genómica a partir del estudio del efecto de las drogas sobre la síntesis de ácidos grasos y ácidos micólicos y de la secuenciación genómica de mutantes resistentes a las drogas. A partir de estudios llevados a cabo con Tiacetazona se comprobó que la enzima esencial b-hidroxiacil ACP deshidratasa de FASII juega un rol inesperado en la resistencia a esta droga. La sobre-expresión del operón que codifica para esta proteína generó resistencia a TAC y además mutantes espontáneas resistentes a TAC presentaron mutaciones en distintas subunidades de la proteína, lo que sugiere que esta enzima sería el blanco esencial de TAC. En el caso de Isoxil la sobre-expresión de la b-hidroxiacil-ACP deshidratasa de FASII generó resistencia a esta droga pero no se han podido encontrar mutaciones en el operón en las mutantes resistentes de M. tuberculosis. Estudios con inhibidores de bombas de eflujo permiten concluir que la resistencia en las mutantes resistentes a ISO aisladas podría deberse a bombas de eflujo que estén expulsando la droga al exterior. Por otro lado, al analizar las mutantes resistentes de M. kansasii, encontramos una mutación silente dentro del operón que estaría generando resistencia a ISO, aunque no se pudo determinar de qué manera lo está haciendo. Estos resultados validan a la b-hidroxiacil ACP deshidratasa de FASII como blanco para el diseño de drogas antituberculosas y abren la puerta para el desarrollo racional de drogas que inhiban esta enzima esencial de micobacterias. Los resultados obtenidos a partir de este trabajo de tesis, junto con estudios estructurales de la b-hidroxiacil ACP deshidratasa, permitirá sintetizar derivados de TAC e ISO con el fin de aumentar su acción bactericida y disminuir sus efectos adversos. Además la información obtenida se podrá utilizar para generar cepas merodiploides en los genes involucrados en la resistencia a fin de poder dilucidar si existen más blancos esenciales de ISO y TAC así como otros mecanismos de resistencia.

El género Mycobacterium incluye especies patógenas de alto impacto en salud pública, como M. tuberculosis (agente causal de la tuberculosis humana), y especies no patógenas como M. smegmatis. La tuberculosis es un problema de salud mundial que causa aproximadamente 1,4 millones de muertes anuales. En los últimos años con la emergencia de cepas de M. tuberculosis multi, extremada y totalmente resistentes a drogas, el estudio de los blancos moleculares de las drogas anti-tuberculosas ya conocidas así como el diseño de nuevas drogas, han sido planteados como necesidades urgentes. En este sentido, la ruta biosintética de los ácidos micólicos (ácidos grasos α- alquil, - hidroxilados de cadena larga (hasta C86) comunes en todas las micobacterias) ofrece un gran potencial para el diseño de drogas debido a que su compleja síntesis requiere de múltiples genes. En el laboratorio se aislaron, mediante mutagénesis química, mutantes de M smegmatis mc2155 termosensibles (TS) y con sensibilidad aumentada a drogas (SAD) que presentaban deficiencias en diferentes tipos de ácidos grasos y micólicos. En este trabajo de tesis se planteó como objetivo principal la caracterización genética y bioquímica de los genes involucrados en los fenotipos observados en estas mutantes teniendo como metas finales la identificación de nuevos blancos para el diseño racional de drogas así como la obtención de nuevos datos acerca de los mecanismos de acción de drogas anti-micobacterianas ya conocidas que actúan sobre esta vía. Para ello se utilizó una estrategia basada en la aplicación de técnicas moleculares que fueron complementadas con estudios fisiológicos, de lipidómica y análisis bioinformáticos, asociados a una extensiva revisión bibliográfica. Los estudio realizados en la cepa mutante UNR21, deficiente en la síntesis de ácidos α’-micólicos, permitieron concluir que en la vía de síntesis de esta sub familia de ácidos micólicos existen genes cuya función aún no ha sido descrita y que no forman parte de la maquinaria descrita hasta el momento. Por otro lado, se identificó un error en la anotación genómica del ORF MSMEG_1204 anotado como β-cetoacil-ACP hipotética. Mediante el análisis de la cepa UNR18 se identificaron probables blancos de acción de TAC en M. smegmatis (bacteria naturalmente resistente a esta droga) en metriltransferasas asociadas a las vías de modificación de ácidos micólicos, diferenciando a este mecanismo del de inhibición de la ciclopropanación propuesto en M. tuberculosis. Así mismo, se identificó al ORF MSMEG_0902 como una MtfsAM involucrada, posiblemente, en la síntesis de ácidos micólicos diciclopropanados. Por otro lado, a partir de las características encontradas en la cepa UNR1 se estudió el efecto de la mutación puntual encontrada en el ORF MSMEG_1886 (codifica para una enzima homóloga a DesA3 de M. tuberculosis) en la vía de síntesis de ácidos grasos insaturados. En este trabajo, se presentaron evidencias de que la mutación C1006T en el ORF MSMEG_1886 probablemente afecta la regioselectividad de DesA3 y además se aportaron resultados que sustentan la función propuesta para esta enzima como desaturasa con especificidad para cadenas carbonadas de longitud C16-C18. Estos estudios se complementaron con un análisis de la desaturación de ácidos micólicos, mediante los cuales se pudo inferir una posible esencialidad de los ORFs MSMEG_5773 y MSMEG_5773 (anotados como desaturasas de ácidos micólicos hipotéticas) así como su asociación al metabolismo de ácidos grasos en M. smegmatis.