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En la presente Tesis Doctoral se realizaron estudios sobre la biosíntesis de aldosterona, en la glándula interrenal de Bufo arenarum, a partir de distintos sustratos tales como corticosterona, 18-hidroxicorticosterona (18-OH-B) y el compuesto "N" que se biosintetiza a partir de pregnenolona pero no de progesterona. A diferencia de lo que ocurre con la 18-OH-B comercial o de rata, la proveniente de interrenales de sapo presenta una forma menos polar única y distinta de las conocidas hasta el momento. Con respecto a la precursoriedad de aldosterona que posee este esteroide 18-hidroxilado, los resultados mostrados indican que esta hormona no es intermediario en la biosíntesis de aldosterona, por lo menos en las condiciones utilizadas para los experimentos presentados en esta Tesis. También se ensayó la capacidad precursora de aldosterona que tiene corticosterona y la conclusión a la que se arribó es que la capacidad biosintética de este conocido intermediario en la síntesis de aldosterona es, también, muy baja. Se caracterizó por diversos métodos el compuesto "N", esteroide muy polar con movilidad intermedia entre 18-OH-B y cortisol en el sistema Bush B5, como el 3β -hidroxi-5-ene análogo de aldosterona (3β ,11β ,21-trihidroxi-5-pregnen-20-ona-18-al). Cuando se estudiaron las propiedades biosintéticas del compuesto "N", este esteroide demostró ser un muy buen precursor para la síntesis de aldosterona. La importante capacidad precursora de aldosterona que posee "N", a la menor precursoriedad de corticosterona y a la falta de capacidad de 18-OH-B, indican que en Bufo arenarum, la isomerización del doble enlace Δ 5 a Δ 4 es un paso muy tardío en el camino biosintético de aldosterona. La transformación del análogo de aldosterona en el mineralocorticoide es catalizada por la enzima 3β -hidroxiesteroide deshidrogenasa-Δ 4 isomerasa de localización mitocondrial. La actividad de la enzima mencionada es regulada por la concentración de sodio del medio, la que parece regular la cantidad de enzima presente en aquella fracción.

Se investigó la citología de células de Rps. palustris, comprobándose que cuando crece anaeróbicamente a a la luz posee un sistema de membranas intracitoplasmáticas continuo con la membrana citoplasmática, que no existe en células que crecen aeróbicamente a la oscuridad. -Por primera vez se reporta la detección de la enzima ALA-S en Rps. palustris crecida en diversas condiciones y medios, habiéndose logrado un método rápido, reproducible y sencillo para la medición de su actividad. -Se caracterizó el producto de la reacción enzimática como ácido delta aminolevúlice. -Se comprobó que en células crecidas aeróbicas, ente en oscuridad los nivles de ALA-S son menores que en células crecidas fotosíntéticamente, sugiriendose un rol regulatorio de la biosintesis de BChl para esta enzima. Los niveles de Succinil-CoA-S y ALA-D no varian al cambiar condiciones. -La enzima de células crecidas fotosíntéticamente tiene un pH óptimo de 7,5 y una temperatura óptima de reacción de 37°C. Ni cisteína, ni glutation, ni 2-mercaptoetanol tienen efecto activador destacable del ALA-S. Tampoco su actividad es afectada por cistina. Su peso molecular es de 61.000 — 64.000. -La enzima de células anaerobias y la de células aerobias presentan el mismo Km para glicina. Ambas se inhiben por producto, 16 que sugiere un posible mecanismo regulatorio. Se trata de una enzima relativamente inestable, aunque en extractos crudos resulta ser bastante estable si ellos no se congelan. -La precipitación con sulfato de amonio del ALA-S de células crecidas anaeróbicamente ocasiona una pérdida irreversible de us su actividad. Como tambien se pierde actividad al filtrar por geles, se dificultó el intento de purificación de la enzima. -Tanto en células crecidas fotosintéticamente como aerobias existen activadores del ALA-S,de bajo peso molecular. En células crecidas aeróbicamente en oscuridad existe un activador del ALA-S de células crecidas fotosintéticameate. Se postula un mecanismo que explicaría la acción de los distintos activadores detectados. -Si se burbujea oxígeno a un cultivo de Rps. palustris crecido fotosintéticamente, cesa inmediatamente la sintesis de BChl y decae la actividad especifica del ALA-S,sin alterar notablemente el crecimiento bacteriano. La pérdida de actividad del ALA-S es una inhibición provocada por el oxigeno, aparentemente sin que decaiga en forma importante el número de moléculas del ALA-S puesto que al cesar dicho burbujeo gaseoso, la actividad enzimática recupera rápidamente sus niveles, afin en presencia de inhibidores de sintesis proteica. La cinética de la activación "in vivo" del ALA-S es de orden cero, postulándose que durante la oxigenación del cultivo se forma un activador. de la enzima asociado a membrana. Si la oxigenación se efectúa en presencia de inhibidores de la sintesis proteica, el ALA-S decae pero la recuperación de los niveles al cesar el burbujeo gaseoso no es tan acentuada como si no hubiera inhibidor. -El ALA-S de células de Rps. palustris crecidas fotosintéticamente y luego oxigenadas se activa espontáneamente en extractos crudos a 0-4°C, dependiendo esta activación fuertemente de la concentración de extracto. -Inhibidores del transporte de electrones y desacoplantes de la fotofosforilación afectan al crecimiento y la biosintesis de BChl en Rps.palustris, sin alterar los niveles de ALA-S.

La presente Tesis describe el metabolismo de esteroides del testículo de Bufo arenamrm como así también algunos aspectos de la regulación del mismo. Durante el período no reproductivo, la biosíntesis de andrógenos (T y DHT) se realiza por una vía Δ5 que incluye al 5Diol como intermediario. P4 se transforma mayoritariamente en derivados reducidos como 5αP y 5αP3αol,20ona. La función biológica de estos esteroides reducidos en el testiculo de B. arenam se desconoce hasta el momento. En los animales capturados durante el período de reproducción, la capacidad biosintética del testículo se modifica. Este cambio va desde el predominio de esteroides con 19 átomos de carbono, que se observa en el período no reproductivo, hacia la formación de esteroides de 21 átomos de carbono. Así, se encuentra aumentada la transformación de P5 en P4 y la producción de 5αP; 5αP3α,20ona; 5αP3α,20(α/β)diol y un metabolito no caracterizado. La disminución de la síntesis de andrógenos, in vitro, se correlaciona con una disminución de la concentración plasmática de los mismos. Este cambio en el patrón esteroidogénico podría relacionarse con el final de la espermatogénesis (que depende de andrógenos) y el comienzo de la época de apareamiento. El mecanismo por el cual ocurren estos cambios consistiría, principalmente, en la reducción de la actividad de la enzima P450C17. Se confirma el fuerte efecto inhibitorio de CNK sobre la actividad de 3βHSD reportado previamente para interrenal de esta especie. SPNL ejerce un 50 % de inhibición de la actividad de C17-20 liasa, pero presenta un menor efecto sobre la hidroxilación en la posición C17. Finasteride es incapaz de inhibir a la 5αRed de sapo independientemente del sustrato utilizado. Esta enzima es de localización microsomal, tiene dependencia de NADPH como cofactor, presenta un Km menor para P4 que para T y un amplio rango de pH óptimo, entre 6 y 8. Las características mencionadas previamente son válidas tanto para la conversión de P4 como de T, lo que estaría sugiriendo la existencia de un único tipo enzimático para ambas reacciones. La falta de sensibilidad a Finasteride y el rango de pH óptimo de esta enzima se asemejan al tipo I caracterizado en mamíferos. Independientemente de la concentración utilizada, el tratamiento agudo con hCG in vitro no tiene efecto sobre la actividad de 5αRed. Sin embargo, el tratamiento crónico con hCG y FSH provoca una reducción de la actividad enzimática. Por otro lado, GnRH induce un aumento de la actividad de 5αRed, sólo en la menor concentración utilizada. Las actividades asociadas a la enzima P450c17 son inhibidas por el tratamiento crónico tanto con FSH como con GnRH en todas las concentraciones utilizadas y con hCG sólo en la mayor concentracion ensayada. Sin embargo, la actividad de 3βHSD no se ve influenciada por ninguno de estos tratamientos. GnRH, cuyos receptores testiculares se caracterizan en esta tesis, reduce la liberación de T inmunoreactiva tanto basal como estimulada por hCG. El efecto sobre la liberación basal de T solo se observa en la concentración más baja, al igual que lo que ocurre sobre la 5αRed. Por otro lado, el bloqueo de la acción de hCG sobre la secreción de andrógenos se ejerce en todas las concentraciones probadas. Estas diferencias sugieren que los mecanismos subyacentes para cada una de las inhibiciones provocadas por GnRH son diferentes.

La biosíntesis del glucano β1-2 cíclico en A. tumefaciens y R. meliloti transcurre por transferencia de residuos de glucosa desde el nucleótido UDP-glucosa a una proteína intermediaria de 235 kDa (P235), presente en las membranas internas, para formar glucooligosacáridos β1-2 unidos covalentemente a la proteína. Cuando los giucooligosacáridos alcanzan un grado de polimerización de 14 a 24 se ciclan y se liberan de la proteína. Lo descripto se esquematiza de la siguiente manera: Etapa 1 P235 + nUDP-Glc -—> P235(G1cfl1-2) + nUDP (el ongación) Etapa 2 P235-(Glcβ1-2)n -—> P235 + (Glcβl-2)ncíclico (terminación, ciclación) Las mutantes cromosomales chvB avirulentas y defectivas en la unión con la planta de A. tumefaciens, son incapaces de sintetizar el glucano β1-2 cíclico por carecer de la proteína intermediaria de 235 kDa. Esto último enfatiza el rol de la proteína intermediaria en la síntesis del glucano. La ausencia de la proteína de 235 kDa es posiblemente el defecto bioquímico primario de estas mutantes, lo que sugiere fuertemente una función del glucano β1-2 cíclico en el proceso infectivo y más específicamente en la adherencia.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017

La resistencia de los microrganismos a los antibióticos de primera línea parauso clínico es un problema global conocido desde hace muchos años. La grancapacidad que las bacterias han desarrollado para enfrentar la acción de losantimicrobianos ha generado en los científicos la necesidad de encontrar nuevoscompuestos bioactivos que posean actividad antimicrobiana frente a las diferentesespecies bacterianas. Debido a las innumerables propiedades que presentan lasnanopartículas, se espera que la plata en su forma elemental y en tamañonanométrico actúe como un antimicrobiano con mejores destrezas con respecto asu forma iónica. De todos los métodos de fabricación de nanomateriales se hacreado un gran interés por el término biosíntesis, que se caracteriza por utilizar lamaquinaria proveniente de microorganismos y/o plantas y por ser eficiente desde elpunto de vista energético y no tóxica. En este contexto, se plantea en este trabajode tesis obtener nanopartículas de plata (NPsAg) a través de un métodoecoamigable y evaluar su actividad como agente antimicrobiano, como así también,su capacidad para modificar el metabolismo oxidativo de bacterias y su toxicidad encélulas humanas, con el propósito de contribuir al conocimiento sobre diversosaspectos involucrados en el posible mecanismo de acción de las mismas. Seencontró que la biosíntesis de NPsAg a partir del sobrenadante de P. aeruginosafue exitosa, obteniéndose NPsAg de tamaño homogéneo y estables. Las mismasfueron efectivas como antimicrobianos frente a diferentes especies bacterianas,superando la acción de la plata en su forma iónica y antibióticos de actual usoclínico. Se observó que las NPsAg produjeron un estado de estrés oxidativo en lascélulas bacterianas estudiadas, mediante el aumento de las especies reactivas del oxígeno y un desbalance en los sistemas antioxidantes protectores. Se logrócuantificar la oxidación de proteínas, lípidos y el daño al ADN, y se expusieron comoevidencia del estrés oxidativo producido por las NPsAg. Se propone el uso de lasNPsAg biosintetizadas como un potencial antimicrobiano para ser utilizado enaquellas infecciones donde el tratamiento con los antibióticos existentes no esviable.

EL glucógeno es el polisacarido de reserva presente en tejidos animales, como así también en algunas algas, plantas superiores, hongos y bacterias. Es un polímero ramificado de D-glucosas unidas entre si por uniones glucosídicas α 1,4 en las cadenas lineales y α 1.6 en los puntos de ramificación. La síntesis del glucógeno involucra tres etapas: a) iniciación, b) crecimiento y c) terminación. Desde el descubrimiento de las enzimas glucógeno sintetasa y ramificante, se planteó la necesidad de conocer como se origina "de novo" una molécula de glucógeno. A partir de resultados obtenidos en hígado de rata y E. coli donde , a partir de un nucleótido-(14C)glucosa se transfiere la marca radioactiva a una proteína, Krisman postuló un modelo para la iniciación de la biosíntesis del glucógeno. En base a este modelo, la síntesis "de noyo" de una molécula de glucógeno involucraría una etapa inicial donde, si no más, por lo menos una glucógeno sintetasa iniciadora, formaría un glucano unido covalentemente a una proteína que serviría como "primer" para la acción conjunta de la glucógeno sintetasa y la ramificante. De esta forma se originarían moléculas de glucógeno unidas a proteína. Por otro lado, la etapa de crecimiento de la molécula de glucógeno ha sido muy bien estudiada. Si bien se conocen todos los mecanismos regulatorios de la glucógeno sintetasa es muy poco lo que se sabe acerca de la regulacion de la enzima ramificante. Esto se debe a la inexistencia de métodos específicos y cuantitativos para medir su actividad enzimática. Teniendo en cuenta las características particulares del cerebro en cuanto al metabolismo del glucógeno, ya que este no lo acumula salvo en casos patológicos, se estudio el proceso de iniciación y ramificación del mismo en este tejido. Los resultados obtenidos en esta Tesis son los siguientes: -Se desarrolló un método específico, sensible y cuantitativo para determinar la actividad ramificante. La metodología propuesta consiste en la determinación específica de las glucosas involucradas en los puntos de ramificaoión. -Se demostró que la estructura final de un polisacárido depende de la especificidad de la enzima ramificante involucrada en su síntesis. -Se demostró que en el cerebro, tejido que no acumula glucógeno en condiciones normales, también es operativo el modelo propuesto por Krisman para la iniciación de la biosintesis del glucógeno. -Se estudiaron, en particular las actividades involucradas en la formacion del "primer" proteico. Se demostró la existencia de más de una actividad glucógeno sintetasa iniciadora.

Fil:Geremía, Roberto Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El presente estudio tiene por objeto: la biosíntesis e identificación de porfirinas formadas in vitro por sistemas de GR o fracciones de los mismos en presencia de ácido delta amino levúlico o porfobilinógeno; la investigación de la naturaleza química de la porfirina descripta por Falk como Pseudouroporifina y su identificación con la aislada de orina de porfiria humana, denominada originalmente "Porfirina 208", finalmente, siendo dicha porfirina de estructura isomérica III, el estadio de su significado biológico y posible intermediario en la biosíntesis del hemo. Se describen una serie de métodos aplicados durante el trabajo, en particular un micrométodo para la determinación cuantitativa de porfirinas, que ha surgido de nuestro laboratorio (114). Además algunas modificaciones interesantes a otras técnicas que han mejorado las mismas desde el punto de vista de su rendimiento. El empleo de distintos sistemas de incubación,, en diferentes condiciones, de atmósfera, temperatura, tratamiento previo, etc, llevó a la elección de un determinado sistema como el más eficaz, es decir que produce un mejor rendimiento, en lo referente a la biosíntesis de la Firiaporfirina III. Con iguales concentraciones de sustrato, a mayor tiempo de incubación, hay mayor síntesis; pero a los 90´ se alcanza aproximadamente, el máximo, de donde el mejor tiempo de incubación es, para nuestros fines, de 90´. El uso de solución fisiológica o de sacarosa 0,25M, como líquido de lavado o disolución, no produce ninguna modificación. Se han estudiado independientemente, cada una de las porfirinas aisladas de los distintos sistemas de incubación, comparativamente, cuando era posible, con los correspondientes isómeros provenientes de fuentes naturales; identificándose así dichas porfirinas. Se aprecia que la fracción "Uroporfirina" consiste de aproximadamente 60% de Uroporfirina III y aproximadamente de 30% de Firiaporfirina III, además de menores cantidades de porfirinas que poseen una movilidad correspondiente a una hexacarbóxilica y otras dos que se sitúan en una posición intermedia entre la Uro-porfirina I y la Uroporfirina III por cromatografía sobre papel. La fracción "Coproporfirina" consiste principalmente de Coproporfirina III y cantidades menores de profirinas hexacarboxílica pentacarboxílica y tricarboxílica, que no habían sido descriptas anteriormente. Estas porfirinas que se encuentran en pequeña cantidad, fueron detectadas utilizando la cromatografía en columna de carbonato de calcio, que demostró ser más sensible para la separación de porfirinas que la cromatografía sobre papel de Falk y Benson. Si el sistema se calienta previamente a 60°C durante más de 15´, ocurren cambios muy significativos en lo que atañe a la naturaleza de las porfirinas sintetizadas, así: la fracción "Uroporfirina" consiste casi exclusivamente de Uroporfirina I y desaparece la Firiaporfirina III; en tanto que el rendimiento de la fracción "Coproporfirina" disminuye considerablemente y ésta consiste sólamente de Coproporfirina I. Cuando se emplea ácido delta amino levúlico como sustrato, aproximadamente un 15% del ALA agregado no se utiliza en la biosíntesis y un 25% se transforma en porfobilinógeno; en tanto que cuando se usa porfobilinógeno como sustrato, aproximadamente un 40% del mismo queda sin utilizar. Utilizando Uroporfirinógeno III-C^14 y Coproporfirinógeno III-C^14 se demuestra por 1° vez su transformación a Protoporfirina IX, confirmándose que el Uroporfirinógeno III y el Coproporfirinógeno II, pero no el UPG I, ni el CPG I, son intermediarios en la biosíntesis del heso. Se han aislado e identificado las porfirinas libres formadas cuando se usaron los distintos porfirinógenos como sustratos, determinándose los porcentajes de los diferentes componentes de cada fracción. Se demuestra que la porfirina descripta por Falk como pseudouroporfirina, es igual a la aislada de orina de porfiria humana, designada como "Porfiria 208" y actualmente como firiaporfirina III. Por otra parte, mediante la técnica I otopica, se establece que el firiaforfirinogeno III, es un intermediario normal, siguiendo al uroporfirianogeno III en la biosíntesis de la protoporfirina IX. Y muy posiblemente la decarboxilación seria un proceso en etapas que ajustaria al siguiente esquema *Ver esquema en tesis*

Las porfirinas y sus derivados se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza. Son compuestos tetrapirrólicos que cumplen funciones fisiológicas fundamentales en todas las células vivas, formando parte como grupos prostéticos de una gran variedad de hemoproteínas, entre las que se hallan la hemoglobina, los citocromos, las peroxidasas, y la catalasa. La biosíntesis del hemo está estrictamente regulada. Si los mecanismos de control fallan o son defectuosos, la sintesis o acumulación de intermediarios en la cadena de dicha camino metabólico puede alcanzar niveles mayores que los normales. Esto trae como consecuencia la aparición de una serie de patologías conocidas como porfirias, entre las cuales se destacan por su importancia las porfirias hepáticas. Dentro de estas últimas se encuentra la porfiria aguda intermitente (PAI), caracterizada bioquímicamente por una sobreproducción hepática de ácido δ-aminolevúlico (ALA) y porfobilinógeno (PBG), metabolitos que son excretados por orina. La afección enzimática de esta porfiria se encuentra a nivel de la enzima Porfobilinógeno - Deaminasa (PBG-D). Actualmente se conoce una gran cantidad de drogas que pueden desencadenar una crisis de porfiria aguda, siendo las más comunes los hipnóticos, barbitúricos, sulfonamidas, esteroides, anestésicos y alcohol. A pesar de que el hígado es el órgano donde los intermediarios ALA y PBG se sintetizan en exceso, los síntomas clínicos predominantes pertenecen casi exclusivamente al sistema nervioso. Además, se ha estudiado extensamente la biosintesis de porfirinas en higado de distintas especies animales pero es muy poca la información existente acerca del metabolismo de las porfirinas en el tejido nervioso. Dado estos antecedentes se decidió estudiar la enzima PBG-D de corteza cerebral y de cerebelo de rata. En la etapa inicial del presente trabajo se planeó determinar las condiciones óptimas para la extracción y medición de la actividad de PBG-D. Una vez obtenida la enzima de ambas fuentes se desarrolló un método para la purificación de la misma y empleando la fracción parcialmente purificada, se efectuaron estudios comparativos de caracterización y cinética. Por otra parte, aún se desconoce cuál es el mecanismo que ocurre en la neuropatía porfirica durante los ataques agudos de PAI. Las distintas hipótesis involucran al ALA como agentes neurotóxico, aunque todavía está en discusión si éste atraviesa o no la barrera hematoencefálica, una vez ocurrida la sobreproducción hepática. Por otro lado el camino del hemopodría estar también alterado en el tejido nervioso, contribuyendo a desencadenar los síntomas característicos de esta patología. Durante los últimos años se ha manejado la hipótesis que el ALA se autooxida generando especies reactivas de oxigeno (ROS) capaces de peroxidar los lípidos de las membranasy producir daño a nivel celular, actuando estas especies comoagentes etiológicos de la PAI. Considerando lo expuesto, fue objetivo de la presente Tesis investigar la captación de ALA y su metabolización a PBG y porfirinas empleando como modelo el sistema de particulado de cerebelo de rata. Para lograr este propósito en primer lugar habia que determinar la viabilidad de los particulados, medida como incorporación de leucina a proteínas y como captación de glucosa. Sobre esta base, nuestro interés fue analizar la respuesta del particulado al agregado exógeno de ALA, variando la cantidad de proteína, la concentración de sustrato ALA y el tiempo de incubación. Paralelamente a estos estudios se determinó la distribución de los metabolitos sintetizados y se identificaron las porfirinas formadas por HPLC. Además fue importante establecer la dependencia energética del proceso de incorporación de ALA a las células del particulado. En incubados a distintos tiempos y variando la concentración de sustrato ALA, se evaluó la formación de ROS, midiendo marcadores de daño celular (TBARS y dienos conjugados) y se estudió el efecto de "scavengers" de ROS como la SOD, la CAT y el DMSO sobre la captación de ALA y la biosíntesis de PBG y porfirinas. Por otra parte y teniendo en cuenta que a los pacientes con PAI se les administra como tratamiento ácido fólico y una dieta en carbohidratos se resolvió llevar a cabo un estudio en particulados de cerebelo acerca de la captación de glucosa en presencia de ALA y el efecto de los distintos "scavengers". Comparativamentese analizó el efecto del ácido fólico sobre la biosintesis de porfirinas en particulado y sobre la actividad de PBG-D de corteza cerebral y de cerebelo de rata. Considerando la acción de las sulfonamidas como desencadenantes de una PAI y dado que la sulfamerazina (SMZ) produce una inhibición no competitiva reversible de la PBG-D de higado de rata, correlacionada con la inhibición encontrada in vivo e in vitro en la PBG-Dde sangre de rata, se estudió el efecto de la SMZ sobre la biosintesis de porfirinas en el sistema de particulados, asi como también sobre la actividad de PBG-D de corteza cerebral y de cerebelo de rata. El conocimiento de la respuesta que brinden las células nerviosas al agregado de ALA exógeno es de sumo interés pues podrá contribuir posiblemente al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.