Catálogo de publicaciones

El gen de susceptibilidad al cáncer de mama (BRCA1) es un supresor tumoral. Las mutaciones germinales en este gen confieren predisposición al cáncer de mama, ovario y están asociadas con una mayor agresividad del cáncer de próstata (PCa). Varias evidencias demuestran que BRCA1 tiene numerosas funciones, sin embargo, no se conoce aún cuál es el rol de este supresor tumoral en el PCa. En esta tesis determinamos por primera vez que BRCA1 regula directamente su propia transcripción y la de otros genes que intervienen en la respuesta al daño en el ADN, el ciclo celular y la apoptosis en el PCa. Establecimos un mecanismo por el cual la regulación de la transcripción de BRCA1 es una característica fundamental en la modulación de la sensibilidad a los agentes genotóxicos. Comprobamos que BRCA1 forma un complejo multriproteico integrado por E2F1 y Rb, que se asocia a su promotor autorreprimiéndolo. Luego del estrés genotóxico generado por doxorrubicina, BRCA1 se libera activando su transcripción y asociándose a los promotores de otros genes, entre ellos GADD153. Así, BRCA1 induce la transcripción de GADD153 aumentando la apoptosis y el arresto del ciclo celular. Además, generamos un modelo in vivo de xenotransplantes de PCa que poseen disminuída la expresión de BRCA1. Con este modelo demostramos que la disminución de la expresión de BRCA1 aumenta el desarrollo tumoral de próstata. Considerando que los agentes quimioterapéuticos utilizados comúnmente en el tratamiento del cáncer causan daño en el ADN, en este trabajo proponemos que el PCa asociado a mutaciones en BRCA1 presentaría una respuesta alterada a la quimioterapia, representando un nuevo subgrupo de pacientes que podrían requerir terapias alternativas. Los tumores de próstata avanzados se tornan rápidamente resistentes a todos los agentes quimioterapéuticos actualmente utilizados. Así, el entendimiento de los mecanismos de resistencia en tumores con mutaciones en BRCA1 ayudará a desarrollar mejores opciones de tratamiento, como por ejemplo, terapias personalizadas para el PCa.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2018

El primer objetivo de este trabajo de tesis fue ensayar la hipótesis de la independencia estructural y funcional del dominio central con un péptido sintético con la secuencia de apoA-I entre los residuos 77 y 120 (AI 77-120). Para ello nos propusimos estudiar: a) la capacidad de AI 77-120 para interactuar con vesículas lipídicas e insertarse en membranas fosfolipídicas artificiales, b) la estructura secundaria y cuaternaria de AI 77-120 en los estados libre y unido a membrana, y c) la actividad de este péptido comparativamente con apoA-I para desorber colesterol de membranas y catalizar su intercambio entre vesículas. El segundo objetivo planteado fue utilizar resonancia electrónica paramagnética (EPR) para estudiar la influencia de la apoA-I y eventualmente del péptido AI 77-120 sobre la movilidad de sondas paramagnéticas localizadas a diferentes profundidades de la membrana de vesículas fosfolipídicas, y en la bicapa de HDL discoidales. Como la interacción de muchas proteínas anfitrópicas con la membrana resulta en un cambio en el ordenamiento y la movilidad de los lípidos de la membrana que depende del modo de inserción, esto podría aportar información útil sobre el modo de inserción. El tercer objetivo del presente trabajo fue utilizar mutantes de apoA-I con un único residuo de triptofano en diferentes posiciones estratégicas del par de hélices Y central para obtener información sobre: a) la conformación de esta región de la proteína en los estados libre, unida a membrana o formando parte de HDL discoidales reconstituidas; y b) el modo y la topología de inserción de esta región de apoA-I en la membrana tratando de distinguir entre los dos modos anteriores.

Drosophila melanogaster es considerado uno de los modelos de estudios genéticos por excelencia. Su utilización incumbe a extensos ámbitos de las ciencias biológicas, incluso la biomedicina y, desde hace pocos años, se ha empezado a utilizar como modelo de enfermedades cardiovasculares humanas. La presente tesis muestra el uso de Drosophila melanogaster como modelo para estudios cardiovasculares, más específicamente el rol de dos proteínas, eIF4E y 4EBP ambas efectores de la vía de señalización, en el ciclado del calcio intracelular y la función cardíaca. En este trabajo, mediante la implementación de técnicas fisiológicas y moleculares se demostró por primera vez que las proteínas eIF4E y 4EBP cuyo rol canónico corresponde al inicio de la traducción en eucariotas, participan en el ciclado del calcio intracelular y en la función cardíaca mediante un rol que no involucra su participación en la síntesis proteica. Hemos demostrado que la isoforma 4 de eIF4E interacciona directamente con la bomba calcio/ATPasa del retículo sarcoplasmático (SERCA) regulando su función y de esta manera modificando el ciclado del calcio en el cardiomiocito. A su vez, mostramos por primera vez la expresión de la proteína eIF4E-4 en tejido cardíaco, indicando que posiblemente ésta sea la isoforma cardíaca de este factor de traducción.

Drosophila melanogaster es considerado uno de los modelos de estudios genéticos por excelencia. Su utilización incumbe a extensos ámbitos de las ciencias biológicas, incluso la biomedicina y, desde hace pocos años, se ha empezado a utilizar como modelo de enfermedades cardiovasculares humanas. La presente tesis muestra el uso de Drosophila melanogaster como modelo para estudios cardiovasculares, más específicamente el rol de dos proteínas, eIF4E y 4EBP ambas efectores de la vía de señalización, en el ciclado del calcio intracelular y la función cardíaca. En este trabajo, mediante la implementación de técnicas fisiológicas y moleculares se demostró por primera vez que las proteínas eIF4E y 4EBP cuyo rol canónico corresponde al inicio de la traducción en eucariotas, participan en el ciclado del calcio intracelular y en la función cardíaca mediante un rol que no involucra su participación en la síntesis proteica. Hemos demostrado que la isoforma 4 de eIF4E interacciona directamente con la bomba calcio/ATPasa del retículo sarcoplasmático (SERCA) regulando su función y de esta manera modificando el ciclado del calcio en el cardiomiocito. A su vez, mostramos por primera vez la expresión de la proteína eIF4E-4 en tejido cardíaco, indicando que posiblemente ésta sea la isoforma cardíaca de este factor de traducción.

Las Enfermedades Inflamatorias Intestinales (EII) son un conjunto de patologías crónicas multifactoriales en las cuales se produce una respuesta inmune aberrante contra componentes de la microbiota intestinal. Dentro de las EII, la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC) son las dos formas más estudiadas. Si bien existen diferencias en la presentación clínica de estas patologías, en ambos casos los linfocitos T (LT) de la mucosa sobre-expresan citoquinas pro-inflamatorias del perfil Th1. La cronicidad de este proceso desencadena complicaciones tales como la formación de abscesos, fístulas, estenosis e inclusive la necesidad de resección quirúrgica de diversos segmentos del intestino debido a lo extenso del daño. Galectina-1 (Gal-1) es una lectina endógena con propiedades anti-infamatorias ampliamente documentadas. Entre los distintos efectos descriptos para esta proteína podríamos mencionar el control de la sobrevida de los LT Th1 y la modulación en la producción de citoquinas. En el presente trabajo de tesis se propuso estudiar la expresión de Gal-1 en la mucosa colónica humana y murina en situaciones fisiológicas y patológicas; analizar la correlación entre la producción de esta lectina y la actividad inflamatoria del tejido y su capacidad de modular la sobrevida de los LT y de las células epiteliales intestinales (CEI) en dichos entornos. Pudimos demostrar que el análisis conjunto de la expresión intestinal de diferentes galectinas permite distinguir entre pacientes con EII activa y pacientes control, EII inactiva o en remisión. Además, concluimos que este análisis es una herramienta eficiente para determinar el grado de inflamación de dicha mucosa y distinguirla de otras patologías inflamatorias intestinales agudas y crónicas. Por lo tanto, podría constituir un marcador de la historia de la patología en el paciente. En cuanto a su rol en la fisiología intestinal, en homeostasis Gal-1 ejerce un efecto pro-apoptótico sobre los LT de la lámina propia colónica, efecto que permite controlar la activación celular frente al constante desafío antigénico por parte de la microbiota. Además, comprobamos que la respuesta fisiológica del intestino frente a un estímulo inflamatorio consiste en inducir un aumento en los niveles de expresión de esta lectina. Sin embargo, este mecanismo compensatorio resulta inefectivo dado que los LT de la lámina propia alteran su maquinaria de glicosilacióin, inhibiendo la expresión de los ligandos específicos para Gal-1. Asimismo, las proteasas presentes en el entorno inflamatorio tisular degradan a esta proteína. Ambos efectos en la lámina propia favorecen la persistencia del foco inflamatorio y la no resolución del daño tisular. Por otra parte, la inflamación sostenida incrementa el porcentaje de CEI que expresan los ligandos para esta lectina. Este fenómeno intensifica el efecto pro-apoptótico que Gal-1 ejerce sobre dichas células. Este mecanismo contribuye a la perdida de la integridad epitelial, la alteración de la permeabilidad intestinal y propicia la traslocación de los antígenos del lumen a la lámina propia. Por lo tanto, en condiciones de homeostasis, Gal-1 contribuiría a la normal fisiología del intestino. Sin embargo, en procesos inflamatorios crónicos, dicho rol se vería alterado, hecho que propiciaría la continuidad de la enfermedad. Una mejor comprensión de los mecanismos que gobiernan la expresión de los ligandos específicos de esta lectina, y el rol que ésta ejerce sobre otras células del sistema inmune, permitirá plantear nuevas terapias o procedimientos para restablecer el glicofenotipo de los LT y de las CEI y, de esta manera, controlar la inflamación intestinal

El cáncer de próstata (CaP) es el segundo tipo de cáncer más frecuentemente diagnosticado en hombres. En estadíos avanzados la enfermedad puede diseminarse siendo el hueso el principal sitio de metástasis. Este no es un evento aleatorio, sino que se generan loops regulatorios de retro-alimentación entre las células de CaP y las células del microambiente de la metástasis, interrumpiendo la homeostasis del hueso. El hueso es un tejido dinámico que se somete a una remodelación mediada por el balance de osteoblastos y osteoclastos. La disrupción de este equilibrio por la presencia de células tumorales convierte el nicho óseo normal en un nicho tumoral o metastásico. Como en otras malignidades la generación de daño oxidativo a macromoléculas y componentes celulares, y el proceso inflamatorio asociado, promueven la carcinogénesis prostática y su progresión. Se ha demostrado que las células óseas producen factores que aumentan el crecimiento y sobrevida de las células tumorales y que esta interacción, a su vez, favorece la progresión metastásica. Sin embargo, la naturaleza molecular de dicha interacción aún no se conoce completamente y existen pocos modelo experimentales apropiados para estudiar dicha interacción. La inducción de Hemo oxigenasa 1 (HO-1) surge como un proceso de defensa celular fundamental frente a estímulos de estrés e inflamatorios. Previamente demostramos que HO-1 cumple funciones críticas antitumorales en la carcinogénesis prostática. Nuestra hipótesis se basa en que HO-1 modifica el microambiente tumoral modulando la expresión de factores inflamatorios y angiogénicos alterando la interacción entre la célula prostática y la ósea. Los objetivos de este trabajo de tesis fueron: evaluar el impacto fisiológico in vivo de la carencia de HO-1 en el metabolismo óseo de ratones Knock-out (KO) para Hmox-1 (gen de HO-1); determinar el perfil transcripcional de genes involucrados tanto en la tumorigénesis como en la remodelación ósea en un sistema de co-cultivo donde células de CaP compartían el medio con cultivos primarios de osteoblastos de ratón (PMOs) aislados de ratones BALB/c Hmox-1 +/+, +/- o -/-; o en co-cultivo con células precursoras de osteoblastos (MC3T3) u osteoclastos (Raw264.7). También analizamos mediante proteómica el secretoma en los medios condicionados del co-cultivo de células de CaP con precursores óseos. El análisis histomorfométrico de los fémures de ratones transgénicos para Hmox-1 reveló una disminución de la densidad ósea concomitante con la pérdida de copias de este gen. En línea con esto se observó un menor número y actividad de osteoblastos y osteoclastos, indicando un metabolismo óseo disminuido. Se observó una correlación entre los niveles de expresión de Hmox-1 y diferentes genes implicados en la diferenciación de osteoblastos o en la regulación de la fisiología ósea como Runx2, Col1a1, Csf-1 y Opg, coincidiendo no solo con el menor número y actividad de osteoblastos, sino también con la disminución general del metabolismo óseo antes mencionada. Mediante citometría de flujo se detectaron dos poblaciones de PMOs con diferentes niveles de ROS; la población con niveles altos estaba significativamente reducida en los animales KO, demostrando que estas células presentaban una tolerancia restringida al estrés oxidativo. En líneas generales, el co-cultivo con células PC3 derivó en un perfil de expresión génica pro-osteolítico en las células óseas, el cual fue parcialmente revertido cuando las células tumorales se encontraban pre-tratadas con Hemina, inductor farmacológico de HO-1. Entre los principales factores alterados se encuentran PTHrP, OPG, RANKL y RUNX2, todos ellos fuertemente implicados en el proceso de remodelación ósea. En resumen, los niveles de HO-1 impactan sobre la expresión de factores osteoblastogénicos y osteoclastogénicos, impactando en el balance óseo y alterando la comunicación entre las células del CaP y las células óseas.

El cáncer de próstata (CaP) es el segundo tipo de cáncer más frecuentemente diagnosticado en hombres. En estadíos avanzados la enfermedad puede diseminarse siendo el hueso el principal sitio de metástasis. Este no es un evento aleatorio, sino que se generan loops regulatorios de retro-alimentación entre las células de CaP y las células del microambiente de la metástasis, interrumpiendo la homeostasis del hueso. El hueso es un tejido dinámico que se somete a una remodelación mediada por el balance de osteoblastos y osteoclastos. La disrupción de este equilibrio por la presencia de células tumorales convierte el nicho óseo normal en un nicho tumoral o metastásico. Como en otras malignidades la generación de daño oxidativo a macromoléculas y componentes celulares, y el proceso inflamatorio asociado, promueven la carcinogénesis prostática y su progresión. Se ha demostrado que las células óseas producen factores que aumentan el crecimiento y sobrevida de las células tumorales y que esta interacción, a su vez, favorece la progresión metastásica. Sin embargo, la naturaleza molecular de dicha interacción aún no se conoce completamente y existen pocos modelo experimentales apropiados para estudiar dicha interacción. La inducción de Hemo oxigenasa 1 (HO-1) surge como un proceso de defensa celular fundamental frente a estímulos de estrés e inflamatorios. Previamente demostramos que HO-1 cumple funciones críticas antitumorales en la carcinogénesis prostática. Nuestra hipótesis se basa en que HO-1 modifica el microambiente tumoral modulando la expresión de factores inflamatorios y angiogénicos alterando la interacción entre la célula prostática y la ósea. Los objetivos de este trabajo de tesis fueron: evaluar el impacto fisiológico in vivo de la carencia de HO-1 en el metabolismo óseo de ratones Knock-out (KO) para Hmox-1 (gen de HO-1); determinar el perfil transcripcional de genes involucrados tanto en la tumorigénesis como en la remodelación ósea en un sistema de co-cultivo donde células de CaP compartían el medio con cultivos primarios de osteoblastos de ratón (PMOs) aislados de ratones BALB/c Hmox-1 +/+, +/- o -/-; o en co-cultivo con células precursoras de osteoblastos (MC3T3) u osteoclastos (Raw264.7). También analizamos mediante proteómica el secretoma en los medios condicionados del co-cultivo de células de CaP con precursores óseos. El análisis histomorfométrico de los fémures de ratones transgénicos para Hmox-1 reveló una disminución de la densidad ósea concomitante con la pérdida de copias de este gen. En línea con esto se observó un menor número y actividad de osteoblastos y osteoclastos, indicando un metabolismo óseo disminuido. Se observó una correlación entre los niveles de expresión de Hmox-1 y diferentes genes implicados en la diferenciación de osteoblastos o en la regulación de la fisiología ósea como Runx2, Col1a1, Csf-1 y Opg, coincidiendo no solo con el menor número y actividad de osteoblastos, sino también con la disminución general del metabolismo óseo antes mencionada. Mediante citometría de flujo se detectaron dos poblaciones de PMOs con diferentes niveles de ROS; la población con niveles altos estaba significativamente reducida en los animales KO, demostrando que estas células presentaban una tolerancia restringida al estrés oxidativo. En líneas generales, el co-cultivo con células PC3 derivó en un perfil de expresión génica pro-osteolítico en las células óseas, el cual fue parcialmente revertido cuando las células tumorales se encontraban pre-tratadas con Hemina, inductor farmacológico de HO-1. Entre los principales factores alterados se encuentran PTHrP, OPG, RANKL y RUNX2, todos ellos fuertemente implicados en el proceso de remodelación ósea. En resumen, los niveles de HO-1 impactan sobre la expresión de factores osteoblastogénicos y osteoclastogénicos, impactando en el balance óseo y alterando la comunicación entre las células del CaP y las células óseas.

El cáncer de próstata (CaP) es el segundo en importancia en el mundo en términos de incidencia. La mayor parte de las estrategias terapéuticas para combatir esta enfermedad están direccionadas a la célula tumoral. Sin embargo, el microambiente tumoral juega un rol preponderante en la progresión de la patología hacia etapas más agresivas. Las estrategias de “pre-acondicionamiento” constituyen una oportunidad poco explorada con vistas a impactar el destino del tumor. En este trabajo usamos hemina, activador e inductor de la enzima homeostática Hemo Oxigenasa-1 (HO-1), en un modelo de pre-acondicionamiento in vivo con el fin de evaluar el desarrollo del CaP. El estroma de ratones inmunocompetentes C57BL/6 fue condicionado por inyección subcutánea de hemina (200 μl, 30 μM) o su vehículo PBS, a lo largo de la semana previa respecto al desafío con células tumorales TRAMP-C1 (T-C1). Los animales pre-acondicionados con hemina mostraron un incremento significativo en la latencia tumoral (57 días en animales pre-tratados con hemina vs. 47 días en los animales control; P<0,01) y una disminución significativa en la tasa inicial de crecimiento (P<0,05). En un intento por comprender las causas subyacentes a este fenómeno, hipotetizamos que dos grandes vertientes podrían dar cuenta de estas observaciones: alteraciones en parámetros vasculares o en el sistema inmunológico, factores del microambiente tumoral determinantes para el desarrollo tumoral. El análisis histológico de estos tumores reveló menor vascularización. La capacidad de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs) de formar estructuras tubulares in vitro disminuyó significativamente por pre-tratamiento con hemina únicamente en presencia de medio condicionado derivado de células T-C1 (P<0,001). En este sentido, se encontró que si bien Galectina-1 (Gal-1) es capaz de promover la angiogénesis in vitro sobre células endoteliales control, el pre-tratamiento con hemina las sensibiliza a la apoptosis inducida por esta lectina (P<0,01), factor secretado en grandes cantidades por las células tumorales. También se estudió si el tratamiento con hemina es capaz de modular el diálogo cruzado entre las células tumorales y las endoteliales. Así, la capacidad migratoria de las células T-C1 se vio significativamente impedida cuando el ensayo de cierre de la herida se realizó en presencia de medio condicionado derivado de HUVECs pre-tratadas con hemina respecto al medio condicionado control (P<0,05). Además, la adhesión de las células T-C1 al endotelio disminuyó cuando las HUVECs fueron pre-tratadas con hemina (P<0,01). Un ensayo de plug de Matrigel in vivo confirmó que el pre-acondicionamiento s.c. con hemina reduce la neo-vascularización tumoral en ratones C57BL/6 (P<0,01). Por otro lado, el tratamiento con hemina potenció la respuesta T CD8+ en términos de proliferación y desgranulación in vitro, incluso en un microambiente tumoral. Para verificar si estos hallazgos eran relevantes in vivo, se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad en animales previamente tratados con hemina o su vehículo. El pre-acondicionamiento con hemina resultó en un incremento significativo de la citotoxicidad antígeno-específica in vivo (P<0,01). Al tratar a los linfocitos efectores con hemina ex vivo previo a su transferencia adoptiva en ratones C57BL/6, la citotoxicidad antígeno-específica también se vio significativamente aumentada (P<0,01). Interesantemente, se observó un aumento sistémico significativo en la frecuencia de linfocitos T CD8+ en ratones portadores de tumores que habían sido pre-acondicionados con hemina (P<0,05). Dichos tumores mostraron una expresión significativamente menor de Gal-1 (P<0,01), modulador clave de la angiogénesis y la inmunidad, evidenciando un claro y persistente remodelado del microambiente tumoral. Datos de expresión a nivel ARNm y proteína pusieron de manifiesto una subpoblación de pacientes de CaP y xenotransplantes derivados de pacientes con CaP, respectivamente, con marcación moderada para HO-1 y baja para Gal-1. En su conjunto, estos hallazgos revelan una función novedosa para hemina en la promoción de la respuesta antitumoral endógena.

El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por esta enfermedad entre los hombres occidentales. Los andrógenos y el receptor de andrógenos (AR) son críticos para el desarrollo del PCa. El AR recluta varios co-activadores/co-represores y factores de transcripción modificando la expresión de genes blanco. Se han identificado varios mecanismos que activan al AR entre ellos la vía de señalización de STAT3. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron la expresión nuclear de HO-1 en carcinomas primarios de próstata. In vitro la inducción de HO-1 disminuyó la proliferación, la invasión y la migración celular y retardó el crecimiento tumoral y la angiogénesis in vivo. Nuestra hipótesis es que HO-1 podría actuar como un co-regulador de receptores nucleares o bien modificar el microambiente tumoral modulando la expresión de factores que actuarían como coreguladores. En este trabajo de tesis nos propusimos investigar si HO-1 afecta la actividad transcripcional del AR a través del eje STAT3. Demostramos que la inducción de HO-1 en las células de PCa reprime la activación del AR, disminuyendo la actividad del promotor y los niveles del ARNm del antígeno prostático específico (PSA). Comprobamos que la sobreexpresión de HO-1 induce arresto del ciclo celular en G2/M. Mediante inmunoprecipitación de la cromatina determinamos que HO-1 se asocia a promotores génicos, revelando una nueva función nuclear para esta proteína. Mediante ensayos de co-inmunoprecipitación mostramos que HO-1 y STAT3 interaccionan directamente. Por medio de microscopía confocal demostramos que HO-1 provoca la retención citoplasmática de STAT3. El tratamiento con hemina (inductor específico de HO-1) impidió la inducción de la expresión de los genes targets de STAT3, coincidente con la disminución de los niveles de pSTAT3 en el núcleo. Estudios in vivo confirmaron la reducción de la localización nuclear de STAT3 en los xenotransplantes de células PC3 que sobre-expresan HO-1. Adicionalmente, NFκB, un factor relevante en la inflamación y que forma complejos con STAT3, también queda inactivo retenido en el citoplasma cuando se induce HO-1. Estos resultados proveen una función nueva para HO-1 reprimiendo la actividad transcripcional del AR en PCa e interfiriendo con la señalización de STAT3. Estos hallazgos sustentan nuestra proposición acerca del nuevo rol que posee HO-1, más allá de su actividad catalítica.