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La dinámica de tecleo permite la identificación de una persona por la forma en que escribe. Esta tesis se enfoca en analizar la robustez de los algoritmos de análisis de cadencia de tecleo frente a variaciones en los registros biométricos mediante electroencefalografía y cuestionario de autoinforme, utilizando el enfoque dimensional para modelizar estados afectivos. Se realizó un experimento para capturar patrones de tecleo en diferentes estados afectivos. Los resultados sugirieron que la tasa de aciertos para ciertas distancias de clasificación, como las métricas A y R, la distancia de Camberra, Manhattan y una distancia basada en Minkowski se ven influenciadas negativamente por los cambios en las respuestas de excitación y valencia. La distancia euclídea fue la menos afectada de las seis evaluadas.

Las células deben sensar y responder a cambios en su ambiente para poder sobrevivir, reproducirse y desempeñar sus funciones fisiológicas. En particular, las células eucariotas usan muchos y variados mecanismos a en de transducir señales del exterior al interior de la célula. Uno muy importante es el que involucra a receptores acoplados a proteínas G heterotriméricas. Estos receptores de siete pasos de membrana, al ser ocupados por sus ligandos, catalizan el intercambio de GDP por GTP en la subunidad Gα de la proteína G asociada, lo que causa la disociación de la proteína G heterotrimérica en Gα y Gβγ. La respuesta a feromona sexual de levaduras es un sistema prototípico de este tipo de mecanismos, muy estudiado bioquímica y genéticamente. En esta vía de transducción de señales, la proteína de andamiaje Ste5 se une a Gβγ libre, lo que causa su reclutamiento a membrana y la activación de una cascada de MAP kinasas, resultando en arresto del ciclo celular y cambios en el patrón de expresión génica. Las curvas dosis-respuesta (DoR) a feromona medidas en distintos puntos de la vía de transducción, como ocupación del receptor, fosforilación de la MAPK del sistema o inducción transcripcional, muestran una sensibilidad muy similar, un fenómeno al que llamamos alineamiento de las curvas dosis-respuesta (DoRA). En esta tesis estudiamos de manera cuantitativa los primeros pasos en la activación de la respuesta a feromona en levaduras; la ocupación del receptor, la activación de la proteína G heterotrimérica y el reclutamiento a membrana de Ste5. Encontramos que el sistema es notablemente robusto a variaciones en la cantidad de receptores, algo que no es fácilmente explicable por la teoría clásica de receptores. Estudiamos el mecanismo responsable de esta robustez, cuyo punto de acción pudimos mapear río arriba del reclutamiento de Ste5. Construimos un modelo matemático completo de la interacción entre el receptor y la proteína G: el modelo Carrousel. El análisis del mismo nos sugirió un mecanismo por el cuál el sistema puede medir la fracción de receptores ocupados en lugar de la cantidad de los mismos, lo que además explica el fenómeno de DoRA. Este mecanismo depende de la interacción fósica reportada entre la proteína RGS (reguladora de la señalización por proteína G, que inactiva al sistema) y el receptor (que lo activa). Pudimos probar que cepas mutantes en las que esta interacción no está presente, no muestran robustez a la cantidad de receptores. Por otro lado medimos curvas DoR del cambio de localización de Ste5 en células con cantidades variables de Ste5. En base a esta información pudimos estimar la afinidad entre esta proteína de andamiaje y sus sitios de unión a membrana en células vivas, y cómo esta afinidad se modula durante la respuesta. Además, estudiamos el efecto de cambios en la abundancia de Ste5 sobre la respuesta, encontrando que la cantidad de esta proteína es un parámetro crítico del sistema.

Fil:Mórtola, Edelmira. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Reflexión sobre la escritura de Rodolfo Walsh como interpelación político ideológica cultural/comunicacional retomando planteos relativos al lenguaje, el discurso, la ideología, la narrativa, la escritura y la cultura que permiten establecer, trazar nuevos mapas, encontrar los puntos de fuga y las multiplicidades en la narrativa de Rodolfo Walsh.

La inmunidad intrínseca es mediada por proteínas expresadas constitutivamente por la célula y que pueden bloquear directamente la replicación viral. Mientras que la activación de la respuesta inmune innata a través de la vía del interferón requiere de varias horas, los efectores de la inmunidad intrínseca se encuentran disponibles incluso antes de la primera interacción entre el patógeno y la célula. De este modo, la inmunidad intrínseca es la primera respuesta frente a las infecciones virales. El estudio de la inmunidad innata e intrínseca no solo aporta conocimientos básicos, sino también, la identificación de potenciales candidatos para el desarrollo de agentes antivirales. Por ello, el presente trabajo de tesis tiene por objetivo general la caracterización de factores mediadores de la respuesta inmune innata e intrínseca. La proteína de la leucemia promielocítica (PML) es una de las moléculas involucradas en la inmunidad intrínseca frente a múltiples virus. PML actúa como centro organizador de estructuras nucleares conocidas como Nuclear Bodies (PML-NBs). Una gran cantidad de virus, tanto con genoma de ARN como de ADN, codifican la información para proteínas que interaccionan y desestabilizan a los PML-NBs con el fin de evadir la respuesta antiviral. Como primer objetivo de este trabajo de tesis, proponemos estudiar el rol antiviral de PML frente a la infección con el flavivirus dengue (DENV) en cultivos celulares. A través de estudios de silenciamiento y sobreexpresión de PML, demostramos que PML ejerce un efecto antiviral frente a los cuatro serotipos de DENV. Más aun, por medio de técnicas clásicas de biología molecular, microscopía confocal y otras técnicas de microscopia de fluorescencia avanzada, demostramos que la proteína NS5 de DENV interactúa con PML con el propósito de neutralizar su efecto antiviral y favorecer la replicación de DENV. En una segunda instancia, con el objetivo de identificar nuevas moléculas o pathways relevantes en infecciones virales, realizamos análisis de microarrays y RNA-Seq de células infectadas con DENV y Zika (ZIKV). Dentro de la lista de pathways obtenidas, decidimos profundizar el estudio sobre la vía del receptor de hidrocarburos de arilo (AhR), debido a su potencial relación con la respuesta innata. En estudios in vitro realizados con ZIKV, demostramos la relevancia de AhR frente a esta infección. La activación e inhibición farmacológica de AhR causa un incremento o disminución de la replicación viral, respectivamente. Estos resultados fueron obtenidos tanto en líneas celulares, como en cultivos primarios de astrocitos y neuroprogenitores. En conclusión, en este trabajo de tesis describimos por primera vez la importancia de PML en la respuesta antiviral intrínseca contra DENV. Además, obtuvimos un perfil de expresión de células infectadas con DENV y ZIKV e identificamos nuevos pathways relevantes en la infección viral. Finalmente, demostramos por primera vez que AhR es un modulador de la replicación de ZIKV.

La inmunidad intrínseca es mediada por proteínas expresadas constitutivamente por la célula y que pueden bloquear directamente la replicación viral. Mientras que la activación de la respuesta inmune innata a través de la vía del interferón requiere de varias horas, los efectores de la inmunidad intrínseca se encuentran disponibles incluso antes de la primera interacción entre el patógeno y la célula. De este modo, la inmunidad intrínseca es la primera respuesta frente a las infecciones virales. El estudio de la inmunidad innata e intrínseca no solo aporta conocimientos básicos, sino también, la identificación de potenciales candidatos para el desarrollo de agentes antivirales. Por ello, el presente trabajo de tesis tiene por objetivo general la caracterización de factores mediadores de la respuesta inmune innata e intrínseca. La proteína de la leucemia promielocítica (PML) es una de las moléculas involucradas en la inmunidad intrínseca frente a múltiples virus. PML actúa como centro organizador de estructuras nucleares conocidas como Nuclear Bodies (PML-NBs). Una gran cantidad de virus, tanto con genoma de ARN como de ADN, codifican la información para proteínas que interaccionan y desestabilizan a los PML-NBs con el fin de evadir la respuesta antiviral. Como primer objetivo de este trabajo de tesis, proponemos estudiar el rol antiviral de PML frente a la infección con el flavivirus dengue (DENV) en cultivos celulares. A través de estudios de silenciamiento y sobreexpresión de PML, demostramos que PML ejerce un efecto antiviral frente a los cuatro serotipos de DENV. Más aun, por medio de técnicas clásicas de biología molecular, microscopía confocal y otras técnicas de microscopia de fluorescencia avanzada, demostramos que la proteína NS5 de DENV interactúa con PML con el propósito de neutralizar su efecto antiviral y favorecer la replicación de DENV. En una segunda instancia, con el objetivo de identificar nuevas moléculas o pathways relevantes en infecciones virales, realizamos análisis de microarrays y RNA-Seq de células infectadas con DENV y Zika (ZIKV). Dentro de la lista de pathways obtenidas, decidimos profundizar el estudio sobre la vía del receptor de hidrocarburos de arilo (AhR), debido a su potencial relación con la respuesta innata. En estudios in vitro realizados con ZIKV, demostramos la relevancia de AhR frente a esta infección. La activación e inhibición farmacológica de AhR causa un incremento o disminución de la replicación viral, respectivamente. Estos resultados fueron obtenidos tanto en líneas celulares, como en cultivos primarios de astrocitos y neuroprogenitores. En conclusión, en este trabajo de tesis describimos por primera vez la importancia de PML en la respuesta antiviral intrínseca contra DENV. Además, obtuvimos un perfil de expresión de células infectadas con DENV y ZIKV e identificamos nuevos pathways relevantes en la infección viral. Finalmente, demostramos por primera vez que AhR es un modulador de la replicación de ZIKV.

La enfermedad quística ovárica es una enfermedad dinámica que genera importantes pérdidas en la industria láctea, caracterizada por una falla en la ovulación, anestro y persistencia folicular. Factores locales participan de manera autocrina y paracrina en la comunicación entre las células foliculares, regulando el desarrollo folicular. El objetivo de esta tesis fue estudiar la participación de las BMPs y AMH en alteraciones ováricas asociadas a la etiopatogenia de la COD. Se utilizaron muestras provenientes de animales con COD espontánea, inducida con ACTH, controles preovulatorios y de un modelo de inducción de folículos persistentes con dosis bajas de progesterona. Los modelos experimentales resultaron apropiados para el estudio de la persistencia folicular y la COD. Se demostró en animales con persistencia folicular un patrón pulsátil de LH de alta frecuencia, baja amplitud y concentración. Además, se encontraron similitudes en las concentraciones de hormonas esteroides entre folículos persistentes y quistes, así como en sus características histomorfométricas. Se hallaron expresiones elevadas de BMP-4, BMP-6, BMPR-1B y sostenidas de BMP-2 en folículos persistentes y quistes. AMH presentó concentraciones elevadas en líquido folicular de folículos con 10 y 15 días de persistencia. Los resultados obtenidos permiten suponer que el desequilibrio en la expresión de factores locales puede cumplir un rol importante en la etiopatogenia de la COD, alterando sistémica y localmente el equilibrio del eje hipotálamo-hipófisis-gónada. Este trabajo aporta herramientas para una profunda comprensión de la etiopatogenia de la COD, mejorando así sus posibilidades de diagnóstico, tratamiento y consecuentemente la eficiencia reproductiva de los rodeos.

Los arabinogalactanos asociados a proteínas (AGPs) son O-glicoproteínas localizadas en las paredes celulares que se expresan ampliamente en todas las especies del Reino Vegetal, desde las algas verdes hasta las plantas vasculares. Los AGPs pertenecen a la superfamilia de glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGP), que son postraduccionalmente modificadas de dos maneras, los residuos de prolina se convierten en hidroxiprolina por hidroxilación enzimática, y luego la hidroxiprolina es O-glicosilada con arabinogalactano (AG). Los AGPs contienen un péptido señal en el extremo amino terminal, y la mayoría de ellos están unidos a la membrana plasmática a través de un anclaje de tipo glicosilfosfatidil-inositol (GPI) codificado en el extremo carboxilo terminal. En Arabidopsis thaliana, se han descrito 42 genes que codifican para diferentes tipos de AGP que se clasifican como AGP clásicos cuando el péptido maduro incluye sólo el dominio O-glicosilado. Un sub-tipo de AGPs clásicos son denominados AG-péptidos, en los que el O-arabinogalactano (AG) es unido a un péptido de sólo 10 a 13 aminoácidos de longitud, que determina la función de la proteína madura. En ese caso, el péptido actúa como una proteína de andamiaje para exponer su AG en la superficie de la célula. En este trabajo se estudió el rol biológico del AG-péptido 21 (AGP21) de Arabidopsis thaliana en el programa de desarrollo de las raíces. El AGP21 se determinó como un gen altamente expresado en las células epidérmicas de la raíz y, a su vez, la falta de los transcriptos que en las plantas mutantes agp21 produce una alteración en el programa de desarrollo del pelo radical y en la expansión en la célula epidérmica. Además, se demostró que la expresión de AGP21 está regulada directamente por el factor de transcripción BZR1 de la vía Brasinoesteroide (BR). Los fenotipos asociados con la interrupción de la vía de señalización BR son similares a los encontrados en el mutante agp21 y en las raíces bloqueadas con el reactivo específico que se une a AGPs llamado beta-glucosil-yariv. En estos casos, se observó un patrón de expresión anómalo en las células epidérmicas, los factores de transcripción que determinan la diferenciación del pelo radical, tales como GL2 (Glabra 2), RHD6 (Root Hair Defective6) y RSL4 (Root Hair Defective6-like 4). En base a los resultados obtenidos, se sugiere que AGP21 estaría actuando al menos parcialmente en la vía de señalización BR para la diferenciación celular de los pelos radicales, en la planta modelo Arabidopsis thaliana.

La enfermedad de Parkinson es una patología neurodegenerativa que afecta al 1% de la población mayor de 60 años. Se caracteriza por déficits motores, temblor en reposo y una pérdida selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la Substantia Nigra Pars Compacta. Otro rasgo típico es la aparición de agregados proteicos conocidos como cuerpos de Lewy cuyo principal componente es una pequeña proteína, α-sinucleína. Esta proteína se une a las membranas lipídicas y en su conformación de α-hélice podría modular la fusión de las vesículas sinápticas con las membranas pre-sinápticas e influiría en la liberación de neurotransmisores. En condiciones patológicas, α-sinucleína sería capaz de unirse a las mitocondrias y se ha propuesto que esta unión provocaría disfunción mitocondrial y estrés oxidativo que colaborarían en el desarrollo de la enfermedad. La hipótesis de este trabajo propone que AS se incorpora a la mitocondria y se distribuye en sus distintos compartimientos. En esas localizaciones, esta proteína generaría disfunción mitocondrial incidiendo negativamente sobre distintos parámetros metabólicos, sobre la dinámica mitocondrial y la autofagia. En el presente trabajo se estudió la localización específica de α-sinucleína en mitocondrias aisladas de cerebro de rata. Se emplearon técnicas de microscopía de fluorescencia, microscopía electrónica de transmisión, Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), fraccionamientos celulares y mitocondriales, western blots y distintos ensayos bioquímicos. Los resultados obtenidos en mitocondrias aisladas mostraron que AS 1μM se asocia a la mitocondria, mayoritariamente en la membrana externa y AS 10μM y 50 μM se encuentra principalmente internalizada. La microscopía electrónica confirmó la localización de α-sinucleína en el interior de la mitocondria y también en la periferia. Mediante un experimento de FRET se demostró un posible rol para el transportador de membrana externa TOM en la incorporación de AS. El análisis de la funcionalidad mitocondrial reveló que α-sinucleína altera el consumo de O2, el potencial de membrana, la producción de ATP y aumenta la generación de especies reactivas de oxígeno. Por otra parte, se utilizaron células SH-SY5Y transfectadas con α-sinucleína para estudiar el efecto sobre la viabilidad celular, la producción de ATP, la generación de especies reactivas de oxígeno, la dinámica mitocondrial y la autofagia. Los resultados revelaron una disminución significativa de la viabilidad, en paralelo a una disminución en la producción de ATP y generación aumentada de especies reactivas. Además, α-sinucleína indujo disipación del potencial de membrana mitocondrial, desbalance de los procesos de fisión-fusión y desencadenamiento de la autofagia y mitofagia. Estos últimos procesos actuarían como un mecanismo de rescate celular disminuyendo la muerte y eliminando la mitocondrias dañadas. Este trabajo agrega evidencia novedosa al conocimiento de la localización de α-sinucleína en los distintos compartimientos mitocondriales, sus efectos sobre la funcionalidad mitocondrial y la relevancia de la disfunción de la organela en el destino celular. De este modo representan una contribución a la comprensión de los procesos que llevan a la patogénesis de la Enfermedad de Parkinson.

El epitelio olfatorio (EO) de vertebrados es conocido por su remarcable propiedad de renovación de neuronas receptoras olfatorias en forma activa a lo largo de la vida, debido a la presencia de células madre neurales. El EO de larvas de Xenopus laevis muestra todas las características de un vertebrado adulto con una robusta capacidad regenerativa, ofreciendo un sistema ideal para el estudio de células madre neurales en adultos y de factores involucrados en la regeneración del tejido y la diferenciación del linaje neuronal. La identidad y características específicas de las células madre neurales del EO siguen siendo poco conocidas. Estudios previos en otros sistemas como en retina de Xenopus, han sugerido que la señalización de Wnt podría ser necesaria para la expresión de Sox2, el cual a su vez activa la expresión de genes proneurales, y bloquea la diferenciación neuronal a través de la activación de Notch. En el presente trabajo, analizamos la expresión de genes marcadores de células madre neurales en el EO de X. laevis. Además, describimos un incremento significativo en el número de células basales proliferativas y el número de células basales que expresan Sox2, durante la regeneración masiva luego de la destrucción del EO mediante el tratamiento con ZnSO4. Por otra parte, hemos observado que la vía de señalización de Wnt/β-catenina es necesaria para la expresión de Sox2 en células basales del EO principalmente durante la regeneración masiva. Sin embargo, en condiciones fisiológicas normales la expresión de Sox2 podría estar regulada por otros factores. No obstante, no se observó activación de las vías no canónicas de Wnt, como Wnt/JNK o Wnt/Ca++, en células basales en condiciones normales. Estos resultados sugieren un importante rol de Sox2 en las células proliferativas indiferenciadas, posiblemente involucrado en el mantenimiento de las propiedades de células neuro-progenitoras, y sugieren que Wnt estaría involucrado en la regulación de la expresión de Sox2 principalmente durante la regeneración. Por otro lado, se analizó la expresión de BDNF en el sistema olfatorio en condiciones fisiológicas normales, así como durante una regeneración forzada inducida por la destrucción química del epitelio olfatorio en larvas de X. laevis. Hemos descripto la presencia y los patrones de expresión de BDNF tanto en el EO como en el bulbo. En condiciones fisiológicas normales, células sustentaculares (gliales) y algunas células basales dispersas expresan BDNF en el EO, así como las células granulares en el bulbo olfatorio. Por otra parte, durante la regeneración masiva, hemos demostrado un aumento drástico de las células basales que expresan BDNF, así como un aumento de BDNF en el bulbo y nervio olfatorio. En conjunto, estos resultados sugieren un papel importante de BDNF en el mantenimiento y la regeneración del sistema olfatorio. En conclusión, nuestro trabajo pone de manifiesto la importancia del epitelio olfatorio de larvas de anfibios como modelo de estudios de procesos de neurogénesis. Así también hemos demostrado que la vía Wnt/β-catenina y la expresión de Sox2 juegan un rol fundamental en procesos de diferenciación de neuronas olfatorias. Por último, el análisis de la regeneración del EO muestra un significativo aumento en la expresión de BDNF y su importancia en procesos regenerativos neurales. Palabras clave: Epitelio Olfatorio, Células madre neurales, Neurogénesis, Neuronas Receptoras Olfatorias, Wnt, Sox2, BDNF.