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En este trabajo se hicieron estudios de anticuerpos circulantes en sueros de bovinos infectados y vacunados e infectados, provenientes de pruebas de vacunas. Dichos animales fueron originarios de zona libre de fiebre aftosa, se vacunaron con vacuna trivalente, tipo Frenkel, hidroxisaponinada y 21 días después se desafiaron con 10 (4) DI50 de virus monoespecífico, junto con bovinos no vacunados (testigos). Todos los sueros fueron analizados por seroneutralización en cultivos primarios de células de riñón de cerdo y luego del desafío se realizaron las lecturas de lesiones provocadas por el virus, habiendo generalizado la infección los testigos, mientras que los vacunados no enfermaron. En éste trabajo se estudiaron los sueros de bovinos desafiados con aftovirus C y de cada uno,diversas sangrías post vacunación y post infección (éstas también de sueros testigos). Los anticuerpos de dichos sueros se analizaron por su unión especifica a polipéptidos inducidos por el virus en preparaciones antigénicas que consistieron en células BHK 21 ,clon 13 infectadas con aftovirus C por 60, 65, 75,90, 120 y 210 minutos. Para poder determinar las diferencias existentes entre todas las preparaciones antigénicas, se estudiaron por inmunodifusión, inmunofluorescencia, cuantificación de virus en sobrenadantes de células infectadas y electroforesis en gel de poliacrilamida de antígenos radioactivos para identificar los polipéptidos presentes y su variación en las diferentes muestras. Los perfiles radioactivos fueron diferentes entre las distintas muestras y a las células sin infectar. En todos los antígenos se presentaron polipéptidos de muy bajo PM(menor P16), correspondiendo la mayor cantidad a 65 y 210 minutos. P20-16 aumentaron en 120 y 2lO minutos. P38 fué alto en 75 minutos y P52 no varió. P63 y P72 turleron mayores valores en 120 y 210 minutos. P88 en 90 y 120 minutos, P100 en 65 y 120 minutos y P120 en 60 y 120 minutos. Los mayores valores de VPo se encontraron en 65, 75, 90 y 120 minutos, mientras que los de VP1-4 en 120 y 210 minutos. La fluorescencia observada hasta 120 minutos post infección podría deberse a polipéptidos primarios, intermedios y maduros del virus. Después de 120 minutos p.i., se observó fluorescencia con alteraciones y cambios morfológicos en las células, provocados por el efecto citopático viral. Se postuló que hasta los 75 minutos post infección existiría virus no desadsorbido y penetrante; entre 75 Y 120 minutos post infección habría progenie viral temprana con posible liberación prelítica y luego de 120 minutos post infección formación y liberación de progenie viral. Los estudios de los antígenos por inmunodifusión con sueros homólogos y heterólogos llevaron a demostrar la presencia de antígeno asociado a la infección viral en 90, 120 y 210 minutos, a pesar de que,por metodologías más sensibles, se detectó P56 en todos los antígenos. También se obtuvieron resultados contradictorios según los lotes de antígeno VIA y su entisuero. Para obtener conclusiones con esta metodología se deberían poseer antígenos puros y antisueros específicos. Los ensayos de inmunodifusión con sueros anti aftovirus O y A dieron reacciones cruzadas; se dedujo que la responsabilidad estaría en antígeno asociado a la infección viral o polipéptidos primarios inducidos por virus en células (excepto P88). De los sueros de conejo anti células infectadas a diferentes tiempos, sólo los correspondientes a 75, 120 y 210 minutos protegieron especificamente para aftovirus, siendo significativos los índices correspondientes al primero y al último. El suero anti antígeno asociado a la infección viral dió protección leve y los sueros de conejo antivirus sobrenadante y concentrado no lo hicieron. Por los análisis realizados sobre los antígenos, no pudimos disernir cuales polipéptidos serían más inductores de anticuerpos protectores en conejo, pero nos inclinamos a pesar que la responsabilidad estaría en los precursores de estructurales, más que en éstos mismos. La producción de anticuerpos protectores a los antígenos indicados, sería el resultado de la acumulación de múltiples determinantes antigénicos, diferentes en calidad y cantidad que los encontrados en el virus sobrenadante. Todos los estudios mencionados fueron necesarios para iniciar el estudio de sueros bovinos desde el punto de vista de contenido proteico y precipitados inmunes analizados por electroforesis en gel de poliacrilamida. Nuestros sueros de cobayo hiperinmune anti virus mostraron la mayor actividad de anticuerpo en las fracciones γ2, βl y β2 globulinas, no habiendo existido correlación con la concentración proteica total. Esta misma falta de correlación entre actividad y concentración se encontró en los sueros bovinos, notandose que en las diferentes sangrías, las fracciones que más aumentaron fueron γl, βl, β2 , inter α - β y α globulinas, de las cuales se sabe que 2 poseen actividad de anticuerpo las γ ,β y trazas en α2 globalinas. Considerando las variaciones encontradas debemos decir que la calidad de anticuerpo pertenece a una clase ó subclase determinada y es independiente de la concentración de la misma, es decir, dentro de la totalidad de moléculas de anticuerpo, solo algunas poseerían una actividad biológica determinada. De los estudios realizados sobre precipitados inmunes entre nuestros antígenos y los sueros de conejo homólogos y heterólogos a dichos antígenos extrajimos las conclusiones necesarias para hacer el estudio en sueros bovinos, caracterizando los polipéptidos precipitados inducidos por virus cn células y su peso molecular aproximado por electroforesis en gel de poliacrilamida. La detección de Ac en sueros de bovinos vacunados e infectados mostró un comportamiento individual, ya que las sangrías de determinados sueros reaccionaron con todos los antígenos, mientras que algunas de otros sueros lo hicieron con unos pocos. La reacción en las sangrías post vacunación fué más intensa (a veces con más de una banda) y hacia mayor variedad de polipéptidos que en las sangrías de testigos. Las sangrías post infección dieron reacciones similares a las de sueros de bovinos infectados. No existió correlación entre los valores de seroneutralización de los sueros bovinos y su respuesta de anticuerpos en unión a diferentes polipéptidos de los antígenos. De los estudios de inmunodifusión entre epitelios linguales bovinos infectados y antisueros de conejo se dedujo que en nuestras preparaciones antigénicas habria partículas iguales ó similares a las existentes en epitelio lingual infectado y el suero de bovinos infectados y vacunados poseerían anticuerpos hacia dichas partículas. La reacción entre anticuerpos de sueros bovinos y polipéptidos inducidos en células por aftovirus fué específica, sin poder descartar la posible existencia de reacciones cruzadas con otros agentes ó de sustancias específicas encontradas naturalmente en el suero del animal. La vacuna (tipo Frenkel) ó el virus replicante formaría anticuerpos hacia determinadas partículas que se detectaron con células BHK infectadas. Los Ac detectados en bovinos infectados y vacunados se dirigieron hacia polipéptidos precursores, intermediarios, maduros y de bajo PM,y tendrían importancia a nivel de protección, considerando que se unieron mayormente hacia estructuras de PM mayor de 70.000 y menor de 20.000, sugerímos que éstos tendrían mayor importancia que la que actualmente se les asigna. De éste trabajo no podemos concluir definitivamente sobre las posibles diferencias a nivel de anticuerpos entre sueros de bovinos infectados y vacunados, pero nos inclinamos a pensar que dichas diferencias irían más allá de anticuerpos circulantes.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016

Durante años se ha considerado que la defensa inmune frente al Streptococcus (S.) pneumoniae (Spn) depende de anticuerpos anticapsulares, que protegen frente a la infección invasiva y a la colonización por este microorganismo. Sin embargo, la inmunidad adaptativa puede ser importante para generar memoria celular frente a la bacteria. Algunas patologías de la infancia como el asma atópico y la deficiencia específica de anticuerpos frente a antígenos polisacáridos (SPAD), parecen predisponer a un riesgo mayor de infección por Spn. Estudiamos la respuesta inmune al Spn en estos pacientes y en individuos sanos (S) en edades pediátricas. En los pacientes asmáticos (A) se observó una tendencia a una menor expresión de CD69 en linfocitos T (LT) convencionales y LTγδ frente al estímulo con Spn. Los LT CD8+ mostraron un aumento en la expresión de CD25 solo frente al estímulo con Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en las células de los A y no en los S. Para evaluar la respuesta Th1 se midieron los niveles de IFN‐γ frente a Spn y a Mtb, encontrándose muy elevados en los A. Al estudiar los pacientes SPAD (P), encontramos varias diferencias en las subpoblaciones de monocitos (Mo) y LT con respecto a los S. Observamos que los Mo CD14++CD16+, se encuentran en proporciones alteradas con respecto a los S a distintas edades, lo que podría relacionarse con una menor capacidad de respuesta T, dado que frente al neumococo los Mo modulan la diferenciación de LT hacia los perfiles Th1 y Th17. La expresión temprana de CD69 en los LT previene la diferenciación hacia el perfil Th17. En los P, los LT CD69+ y LTCD8+CD25+ se vieron disminuidos con respecto a los S, aún con Mtb, evidenciando alteraciones en su capacidad de respuesta celular. Creemos que nuestro reporte de alteraciones en los P puede ser útil en la búsqueda de otros métodos diagnósticos. Consideramos que deben evaluarse en los Mo las vías de señalización necesarias para activar a las células presentadoras de antígeno frente al neumococo, encargadas de modular la respuesta T en condiciones normales. Esto podría contribuir a identificar la base molecular de la inmunodeficiencia SPAD, aún desconocida.

Dada la influencia de factores de riesgo cardiovasculares (FRC) como tabaquismo, alcoholismo e hipertensión, sobre el desarrollo de lesiones cardíacas, se estudiaron individuos con infección crónica para analizar la relación entre la presencia de estos FRC, grado de cardiopatía y presencia de anticuerpos propuestos como posibles candidatos para el desarrollo de la enfermedad de Chagas. Estos anticuerpos están dirigidos hacia antígenos de T. cruzi como cruzipaina (Cz), antígeno ribosomal P (P2) y un componente de las vainas de mielina, también presente en T. cruzi (sulfátidos). Los individuos fueron clasificados en cuatro grupos según serología específica y presencia de FRC: individuos con infección por T. cruzi y FRC; seropositivos sin FRC; seronegativos con FRC y seronegativos sin FRC. Los seronegativos o seropositivos con FRC mostraron mayor afectación cardíaca (anormalidades en RX y/o electrocardiograma). Los seropositivos con FRC tuvieron niveles de anticuerpos antisulfátidos significativamente mayores que los otros tres grupos y niveles mayores de anticuerpos hacia Cz y P2 que los seropositivos sin FRC. También se encontraron cantidades mayores de anticuerpos hacia P2 y sulfátidos en seropositivos con marcado compromiso cardíaco. La presencia de FRC está asociada con un perfil diferente de respuesta en anticuerpos y de grado de compromiso cardíaco. Además, dado el rol de la respuesta inmune del huésped en la relación huésped-parásito, se estudiaron marcadores de ADN de los alelos dicloro-1-[beta]-D-ribofuranosyl-benzimidazol 1 (DRB1) de los antígenos de linfocitos humanos (HLA). El alelo DRB1*0409 fue significativamente más prevalente en individuos seropositivos, observándose una tendencia para los alelos DRB1*0701 y DRB1*1503.

El alfaherpesvirus equino 1 produce alteraciones reproductivas que ocasionan importantes pérdidas económicas, además de las que suceden a nivel respiratorio y nervioso. En esta tesis se utilizó el modelo murino BALB/c para estudiar algunos cambios en el útero y las placentas de ratonas preñadas y experimentalmente infectadas que pudieran producir la pérdida de continuidad del conceptus. Se describieron las lesiones en los pulmones, el útero y las placentas y se estudiaron los cambios vasculares y en la proliferación y muerte celular por inmunohistoquímica. Se analizaron los niveles en la expresión de algunas citoquinas por qPCR, citometría de flujo y por ELISA. Las ratonas infectadas manifestaron signos clínicos respiratorios y en sus pulmones lesiones histopatológicas típicas, con aislamiento viral y detección de ADN positivos. En las placentas infectadas el aislamiento viral y detección de ADN fueron negativos. Sin embargo, presentaron congestión vascular, ocasionales trombos en pequeños vasos de las capas de espongiotrofoblasto y decidua, aumento en el área del laberinto, y reducción significativa en el endotelio capilar fetal. También se redujo significativamente la proliferación celular, mientras que la apoptosis fue significativamente mayor. La regulación local de la expresión de IL-10, TNF-α, IFN-γ, Foxp3 e IL-4 también difirió en el útero y las placentas del grupo infectado con respecto al control. Hubo un fuerte incremento de la respuesta Th1, mayormente representado por IFN-γ, acompañada por una respuesta Th2 tolerogénica, cuyo fin podría ser restaurar el balance homeostático ante la infección. Los datos obtenidos permiten afirmar que se producen cambios celulares y moleculares a nivel de la respuesta inmune local debido a la infección. La comprensión del impacto inmunológico de la infección sistémica y local por el virus en el modelo murino ayudará a abordar estudios en equinos para mejorar las estrategias profilácticas y terapéuticas.

El alfaherpesvirus equino 1 produce alteraciones reproductivas que ocasionan importantes pérdidas económicas, además de las que suceden a nivel respiratorio y nervioso. En esta tesis se utilizó el modelo murino BALB/c para estudiar algunos cambios en el útero y las placentas de ratonas preñadas y experimentalmente infectadas que pudieran producir la pérdida de continuidad del conceptus. Se describieron las lesiones en los pulmones, el útero y las placentas y se estudiaron los cambios vasculares y en la proliferación y muerte celular por inmunohistoquímica. Se analizaron los niveles en la expresión de algunas citoquinas por qPCR, citometría de flujo y por ELISA. Las ratonas infectadas manifestaron signos clínicos respiratorios y en sus pulmones lesiones histopatológicas típicas, con aislamiento viral y detección de ADN positivos. En las placentas infectadas el aislamiento viral y detección de ADN fueron negativos. Sin embargo, presentaron congestión vascular, ocasionales trombos en pequeños vasos de las capas de espongiotrofoblasto y decidua, aumento en el área del laberinto, y reducción significativa en el endotelio capilar fetal. También se redujo significativamente la proliferación celular, mientras que la apoptosis fue significativamente mayor. La regulación local de la expresión de IL-10, TNF-α, IFN-γ, Foxp3 e IL-4 también difirió en el útero y las placentas del grupo infectado con respecto al control. Hubo un fuerte incremento de la respuesta Th1, mayormente representado por IFN-γ, acompañada por una respuesta Th2 tolerogénica, cuyo fin podría ser restaurar el balance homeostático ante la infección. Los datos obtenidos permiten afirmar que se producen cambios celulares y moleculares a nivel de la respuesta inmune local debido a la infección. La comprensión del impacto inmunológico de la infección sistémica y local por el virus en el modelo murino ayudará a abordar estudios en equinos para mejorar las estrategias profilácticas y terapéuticas.

Las hembras de los mamíferos son susceptibles a padecer inflamación de la glándula mamaria (GM), o mastitis, siendo esta enfermedad particularmente problemática para el ganado lechero bovino (Bos taurus). Las bacterias del género Staphylococcus presentan la capacidad de colonizar el tejido epitelial mamario, a veces, formando biofilm y de este modo evaden las respuestas inmunes del hospedador, siendo un factor de virulencia asociado a la persistencia de la enfermedad. La dificultad en la erradicación de las infecciones mediante el uso de antibióticos subraya el interés por el desarrollo de nuevas herramientas de control. Quitosano (Q) es un polisacárido natural biocompatible y bioactivo, atractivo para su aplicación en el campo farmacéutico y médico. El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de Q sobre aislamientos bacterianos del género Staphylococcus formadores de biofilm y en la modulación de la inmunidad de la GM bovina. Se evaluaron factores de virulencia asociados a adhesión y formación de biofilm en Staphylococcus aureus (n=127) y Staphylococcus coagulasa-negativos (n=82) de infecciones intramamarias, demostrándose la capacidad para formar biofilm y la presencia, principalmente, de los genes clfA, clfB, fnbpA, icaA y icaD. Q presentó actividad antimicrobiana sobre S. aureus V329 (concentración inhibitoria mínima (CIM) 156,25 μg/ml) y Staphylococcus sp. 1007 (CIM 78,13 μg/ml), redujo la cinética de crecimiento bacteriano y afectó la integridad de la membrana en forma dosis dependiente en cultivos planctónicos. El tratamiento de biofilm con Q indujo una disminución de la biomasa y reducción de la viabilidad. En cultivos de células MAC-T, Q inhibió la internalización de S. aureus V329 aumentando los niveles de expresión de receptores de reconocimiento (TLR-2 y TLR-4) como de citoquinas pro-inflamatorias (IL-6 e IL-8). Los co-cultivos con Q y lisados de S. aureus V329, incrementaron los niveles de expresión de ARNm de TLR-2, TLR-4, IL-8, TNF-α y CCL-2; y la producción de IL-1β. La aplicación intramamaria de Q (5 mg) en bovinos indujo aumentos en el recuento de células somáticas, en los niveles de expresión de ARNm de TLR-4, IL-1β, IL-6 e IL-8, y en la producción de IL-1β. Debido al gran número de aislamientos de Staphylococccus spp. formadores de biofilm demostrada, Q podría ser un candidato prometedor para el desarrollo de estrategias de prevención y/o tratamiento de la mastitis. Su capacidad para controlar el crecimiento microbiano y la formación de biofilm, como de modular al sistema inmune de GM bovina, potenciarían la respuesta inflamatoria necesaria para una efectiva respuesta protectora frente a bacterias del género Staphylococcus.

Tesis para obtener el grado de Magíster Scientiae en Producción Animal, de la Universidad Nacional de Mar del Plata, en agosto de 2015

Tesis para obtener el grado de Magíster Scientiae en Sanidad Animal, de la Universidad Nacional de Mar del Plata, en agosto de 2012

La inhibición parcial de la síntesis proteica por cicloheximida o ayuno total de nutrientes en Neurospora crassa, produce la inducción de varios genes. Se clonaron dos de ellos, cuyos transcriptos aparecen luego de apenas media hora de agregado el inhibidor. Se identificaron asimismo, los productos de traducción de estos genes y se demostró que la aparición de los mRNAs correspondientes está acompañadade su traducción. Las proteínas de 27 kD y 31 kD están entre las sintetizadas en mayor abundancia luego de la inhibición parcial de la sintesis proteica y corresponden a los productos de los genes clonados. Estos genes serían inducibles por otras situaciones capaces de inhibir la síntesis proteica, como el agregado de puromicina o el ayuno por 12 horas en buffer fosfato. No serían, sin embargo, inducibles por shock térmico. Uno de los genes se expresaría en forma constitutiva en una cepa que carece de la enzima ornitina decarboxilasa, cuando crece en presencia de espermidina. El clon genómico que contiene a este gen completo fue secuenciado totalmente.