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En el presente trabajo de tesis investigamos aspectos relacionados con el acoplamiento entre la transcripción y el splicing alternativo. Utilizando como modelo al exón alternativo EDI de la fibronectina humana, encontramos que la elongación transcripcional es un importante modulador del splicing alternativo. El Ag T de SV40 activa la replicación del DNA 2 veces, la transcripción entre 12 y 20 veces, y es capaz de provocar un incremento de 25 veces en la inclusión del exón EDI. El efecto del Ag T es específico de exón, ocurre en cis y depende de la replicación del DNA y no de la transformación celular. VP16, un activador de la iniciación y elongación transcripcionales tiene un efecto similar en la transcripción pero opuesto sobre el splicing: inhibe la inclusión de EDI 35 veces. Es más, esta proteína viral es capaz de revertir el efecto del Ag T sobre el splicing de EDI. Consistentemente se determinó que la replicación es capaz de modificar la estructura cromatínica del molde y de ese modo alterar la capacidad elongadora de la RNA pol II. Por otro lado, el enhancer transcripcional del SV4O (una secuencia capaz de aumentar la capacidad elongadora de la RNA pol II) favorece la exclusión del exón EDI en forma independiente de los niveles de RNA. De este modo, la modulación de la capacidad elongadora de la RNA pol II aparece como una nueva forma de regular el splicing alternativo. Independientemente se determinaron dos hechos de importancia: ni el sitio intranuclear de transcripción, ni el reclutamiento de proteínas de splicing por la maquinaria transcripcional parecen tener una influencia importante sobre la decisión de inclusión del exón EDI en el transcripto maduro.

Los niveles intracelulares de ácido araquidónico (AA) son regulados en respuesta a diferentes agonistas en distintos tejidos. El AA es el precursor común de una familia de lípidos con un papel clave en la fisiología y fisiopatología. La actividad biológica de los eicosanoides explica la existencia, en los distintos tipos celulares, de mecanismos apropiados para controlar rigurosamente los niveles de AA libre. Las enzimas ACSL, (Acil-CoA sintetasas de cadena larga), catalizan la síntesis de acil-CoA de ácidos grasos de cadena larga. Un miembro de esta familia es la enzima AcilCoA sintetasa 4 (ACSL4), enzima que tiene preferencia por los ácidos grasos poliinsaturados, en particular por el AA, y un rol importante en el control de los niveles intracelulares de AA libre. En los últimos años se ha estudiado el rol de ACSL4 y su regulación en distintos procesos. En células esteroidogénicas la liberación de AA en la mitocondria involucra la acción conjunta de ACSL4 y una acil-CoA tioesterasa mitocondrial (Acot2), que actúan de forma concertada para regular los niveles intracelulares de AA. Este evento es obligatorio para la inducción de la proteína StAR, necesaria para el transporte de colesterol a la mitocondria. Este proceso es el paso limitante de la síntesis de todas las hormonas esteroides. ACSL4 es regulada por acción hormonal tanto en la fase aguda como crónica de la esteroidogénesis. El cerebro es también un tejido esteroidogénico ya que posee las enzimas requeridas para producir esteroides (neuroesteroides) a partir de colesterol. Los mecanismos que operan en la regulación de la producción de esteroides en sistemas esteroidogénicos clásicos están bien caracterizados, en contraste con lo descripto respecto a la producción de neuroesteroides. Dado que ACSL4 se expresa en sistema nervioso, en este trabajo se estudia su rol en células neuroesteroidogénicas. El AA juega un rol importante en cáncer de colon, hígado, próstata y mama. En tumores cáncer de mama triple negativos se detecta una mayor expresión de ACSL4 respecto de los tejidos normales. ACSL4 confiere mayor agresividad tumoral, incrementando la migración, proliferación e invasión celular, mediante un mecanismo que involucra un aumento de la producción de eicosanoides. Además, se ha descripto que un incremento en la expresión de ACSL4 disminuye la expresión del receptor de estrógenos α (ER), promoviendo la resistencia al tamoxifeno. En este trabajo hemos estudiado un aspecto poco caracterizado respecto a ACSL4, como los mecanismos transcripcionales que actúan sobre la regulación de los niveles de ACSL4 en los distintos modelos de cáncer de mama humano. El rol de ACSL4 en la regulación de los niveles intracelulares de AA señala la importancia de completar la caracterización molecular y funcional de esta enzima. El objetivo general de este trabajo de tesis fue analizar aspectos regulatorios y funcionales de ACSL4 en diferentes modelos. Para responder a este objetivo, mediante técnicas de biología molecular se clonó el promotor humano de ACSL4 y se caracterizó funcionalmente en líneas de cáncer de mama de diferente agresividad. Además, se evaluó la regulación de la expresión y función de ACSL4 en modelos neuroesteroidogénicos. Se analizó la regulación transcripcional de ACSL4 en líneas de cáncer de mama de diferente agresividad. La actividad del promotor resultó ser mayor en líneas de cáncer de mama triple negativas con respecto a líneas de baja agresividad. Se demostró por primera vez que el factor de transcripción Estrogen Related Receptor Alpha (ERRα) está implicado en la regulación diferencial del promotor en líneas de cáncer de mama, siendo al menos en parte responsable de la sobreexpresión de esta enzima en líneas triple negativas. El extremo 3´ del promotor sería esencial para que ERRα pueda ejercer su acción. Se demostró que la inhibición de ACSL4 y ERRα produce un efecto sinérgico sobre la proliferación de células triple negativas. Estos resultados refuerzan la hipótesis de que ambas moléculas estarían involucradas en el desarrollo del fenotipo agresivo. Los resultados obtenidos también indican que el ER ejercería una regulación negativa sobre la expresión de ACSL4 en células de cáncer de mama. ERRα y ER participarían en la regulación de la expresión diferencial de esta enzima en los distintos modelos de cáncer de mama y explicarían, en parte, su sobreexpresión en tumores triple negativos. Otros hallazgos de este trabajo sugieren la participación de los factores de transcripción RORα, Sp1 y la familia E2F en la regulación del promotor humano de ACSL4. Para analizar la regulación y función de ACSL4 en modelos neuroesteroidogénicos se empleó como modelo cultivos primarios de astrocitos de rata. Se demostró un incremento de la expresión de ACSL4 por un mecanismo dependiente de AMPc. Como ocurre en sistemas esteroidogénicos clásicos, comprobamos que esta enzima está implicada en la regulación de la expresión de StAR y en la producción de hormonas esteroides mediada por AMPc. Por otro lado, se demostró que ACSL4 participa también en la migración y proliferación de células neuroesteroidogénicas. En síntesis, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis aportan conocimientos sobre la regulación y función de ACSL4. Los estudios realizados en el modelo neuroesteroidogénico amplían los conocimientos del rol de esta enzima en la esteroidogénesis y en las funciones que cumple en células de la glía. Los resultados obtenidos en el modelo de cáncer de mama aportan conocimientos que sustentan las bases para abordar, en un futuro, el estudio de ACSL4 y ERRα como nuevos blancos terapéuticos para el desarrollo de tratamientos en la terapia del cáncer de mama altamente agresivo.

Fil:Rossi, Susana Graciela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La obesidad y otras disfunciones asociadas al síndrome metabólico tienen una prevalencia creciente en la actualidad. El aumento de tejido adiposo resulta principalmente de una combinación del aumento del número de adipocitos y el tamaño de los mismos. En consecuencia, comprender los mecanismos moleculares que regulan la formación del tejido adiposo resulta de gran utilidad para detener el avance de dichas patologías. La adipogénesis es el proceso durante el cual un fibroblasto comprometido, o preadipocito, se diferencia a adipocito maduro. En este trabajo nos propusimos estudiar el papel que cumple el receptor de insulina (IR) en esta diferenciación. Tomamos como modelo la línea celular 3T3-L1, formada por preadipocitos que, en las condiciones adecuadas y bajo el estímulo hormonal correcto, son capaces de diferenciar a adipocitos. Demostramos que la correcta modulación de las isoformas de IR (IR-A e IR-B) resulta clave para el desarrollo exitoso de este proceso. Realizamos ensayos de silenciamiento y sobre-expresión de las distintas isoformas de IR. Utilizando la técnica de CRISPR/Cas9, generamos líneas estables deletéreas para IR, las cuales perdieron su capacidad de diferenciar terminalmente. Encontramos que la reexpresión del receptor en este contexto permite recuperar algunas características claves que poseen las células diferenciadas. Por otro lado, efectuamos diversos ensayos de manipulación génica con el fin de estudiar la regulación de la localización subcelular de IR. Demostramos que IR puede ser detectado en la fracción nuclear, tanto de células indiferenciadas como terminalmente diferenciadas. Estos resultados refuerzan la importancia de IR en el proceso de diferenciación adipocitario y contribuyen a la comprensión de los procesos que llevan a trastornos metabólicos relacionados con la falla de la acción de dicho receptor.

Resumen temporalmente no disponible. La presente obra no cuenta con resumen provisto por el autor.

La manipulación de reguladores globales es una de las estrategias utilizadas para la construcción de cepas bacterianas adecuadas para la síntesis de bioproductos, debido a que este tipo de reguladores controlan, de forma conjunta, los flujos de carbono y poder reductor. Sin embargo, los efectos pleiotrópicos de estos reguladores pueden variar en diferentes condiciones y a menudo dependen de la cepa de trabajo. En este estudio se analizaron los efectos de ArcA, CreC, Cra y Rob usando mutantes de deleción única de la cepa BW25113 de Escherichia coli (E. coli), la cual está bien caracterizada y completamente secuenciada. La comparación de los efectos de cada regulador sobre la síntesis de los principales metabolitos extracelulares, la tolerancia a varios compuestos y la síntesis de bioproductos nativos y no nativos en diferentes condiciones de crecimiento permitió la discriminación de los fenotipos particulares que se pueden atribuir a las mutantes individuales, y destacó a las mutantes Δcra y ΔarcA, en las que se observaron los efectos más importantes sobre el metabolismo bacteriano. A partir de estos datos, en una prueba de concepto para analizar si sus contextos metabólicos eran adecuados para la síntesis de los biocompuestos reducidos, se utilizaron estas cepas como plataformas para la síntesis de succinato y 1,3-propanodiol (PDO). La mutante Δcra se modificó adicionalmente para potenciar la síntesis de succinato mediante la adición de enzimas que aumentan la disponibilidad de NADH y CO2, logrando un aumento del 80% en comparación con la cepa salvaje. La producción de PDO en la mutante ΔarcA se optimizó mediante la sobreexpresión de la proteína PhaP, que permitió un aumento del 230% en la síntesis del diol en comparación con la cepa salvaje. En un medio semidefinido, usando glicerol como fuente de carbono, los cultivos en biorreactor de esta cepa alcanzaron 24 g.L-1 de PDO después de 48 h, con una productividad volumétrica de 0,5 gL-1h-1.

La manipulación de reguladores globales es una de las estrategias utilizadas para la construcción de cepas bacterianas adecuadas para la síntesis de bioproductos, debido a que este tipo de reguladores controlan, de forma conjunta, los flujos de carbono y poder reductor. Sin embargo, los efectos pleiotrópicos de estos reguladores pueden variar en diferentes condiciones y a menudo dependen de la cepa de trabajo. En este estudio se analizaron los efectos de ArcA, CreC, Cra y Rob usando mutantes de deleción única de la cepa BW25113 de Escherichia coli (E. coli), la cual está bien caracterizada y completamente secuenciada. La comparación de los efectos de cada regulador sobre la síntesis de los principales metabolitos extracelulares, la tolerancia a varios compuestos y la síntesis de bioproductos nativos y no nativos en diferentes condiciones de crecimiento permitió la discriminación de los fenotipos particulares que se pueden atribuir a las mutantes individuales, y destacó a las mutantes Δcra y ΔarcA, en las que se observaron los efectos más importantes sobre el metabolismo bacteriano. A partir de estos datos, en una prueba de concepto para analizar si sus contextos metabólicos eran adecuados para la síntesis de los biocompuestos reducidos, se utilizaron estas cepas como plataformas para la síntesis de succinato y 1,3-propanodiol (PDO). La mutante Δcra se modificó adicionalmente para potenciar la síntesis de succinato mediante la adición de enzimas que aumentan la disponibilidad de NADH y CO2, logrando un aumento del 80% en comparación con la cepa salvaje. La producción de PDO en la mutante ΔarcA se optimizó mediante la sobreexpresión de la proteína PhaP, que permitió un aumento del 230% en la síntesis del diol en comparación con la cepa salvaje. En un medio semidefinido, usando glicerol como fuente de carbono, los cultivos en biorreactor de esta cepa alcanzaron 24 g.L-1 de PDO después de 48 h, con una productividad volumétrica de 0,5 gL-1h-1.

Se efectuó la determinación experimental de las variaciones de pH de una suspensión de carbonato de calcio en función del agregado de solución de cloruro férrico, y a la inversa, agregando la suspensión de carbonato de calcio sobre la solución de cloruro férrico. Mientras hubo exeso de carbonato de calcio, se obtuvo en el primer caso, una meseta descendente entre pH 7,25 y 6,50 aproximadamente. Procediendo a la inversa, se estabilizó el pH en 7,25, mientras que si la suspensión era agregada sobre agua destilada,se alcanzaba un pH de 7,50, en cambio la suspensión misma de carbonato de calcio tenía como valor medio pH 8,36. Para explicar estas discrepancias, se estudiaron teóricamente los factores que podian determinar el pH de esos sistemas, encontrandose la fórmula siguiente, válida para los sistemas en equilibrio: (ver fórmula en la tesis) en la cual K tiene un valor calculado igual a 6,67, pf Cl2Ca es igual a - log f Cl2Ca, siendo fCl2Ca el coeficiente de actividad media del cloruro de calcio, y pCa = -log [Ca++]. Esta fórmula se comprobó experimentalmente con suficiente aproximación, encontrándose para K el valor 6,24 , concordante con el calculado. Por lo demás, los valores observados correspondientes a la suma de los dos últimos terminos de la ecuación se encuentran sobre una recta con pendiente de 45° , como era de esperarse. La aplicación de esta ecuación a los casos considerados primeramente, permitió determinar que los mismos no se encontraban en equilibrio, incluyendo la suspensión pura de carbonato de calcio, la cual por estar preparada con agua hervida, daba un pH de 8,36, siendo su valor para el estado de equilibrio con el aire igual a 7,85 calculado y 7,80 observado. En todos los otros casos los valores de pH son interiores a los correspondientes al equilibrio, por retener las soluciones cierta cantidad de anhidrido carbónico, que solo ee elimine lentamente. Las consideraciones hechas sobre la teoria del poder regulador, nos llevaron a aceptar que el poder amortiguador β, viene dado por la suma de un poder regulador verdadero ρ producido por mecanismos quimicos, y de un valor β0 que depende del pH de la solución unicamente, osea β=ρ+β0 por lo tanto β nunca se anula, pues cuando ρ se hace 0,β=β0. Se demostró una fórmula general para la ecuac16n de Henderson, cuya segunda derivada se anula en el punto de máximo poder buffer, y de la cual pueden deducirce las ecuaciones aproximadas ya conocidas para el pH de los ácidos y bases débiles en soluciones puras,y en cualquier grado de neutralización parcial hasta llegar a las sales puras en solución inclusive. Se demostró que el criterio de Prelat en su definición de poder buffer no es aceptable por cuanto su derivada no se anula en el punto de máxima capacidad reguladora. Respecto del poder regulador de la suspensión de carbonato de calcio, se dedujo una ecuación que demuestra que al contrario de lo que ocurre en los sistema homogéneos, en éste caso el poder regulador aumenta constantemente sin pasar por ningún maximo. Esto se comprobó además en forma experimental.

This thesis aims to prove Besov regularity properties of temperatures. The results by David Jerison and Carlos Kenig for the elliptic case, suggest that, for solutions of the heat equation in cylindrical domains based on Lipschitz regions, some Besov regularity properties in the space variables could become, under diffusion, into joint space-time regularity. The main result contained in this thesis shows that this joint regularity in space and time is attained if the space regularity has some precise integrability properties in the time variable. The most technical aspects of this thesis are precisely those needed to get that integrality property. Moreover, the central tool is a pointwise estimate for the gradients of temperatures in terms of the iteration of two well known operators in harmonic analysis: the one sided Hardy-Littlewood maximal operator and the Calderón maximal function. To introduce a way to measure the joint regularity in space and time, we introduce through interpolation a family of Parabolic Besov spaces.