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a) Caracterizacion de los RP-BZDs: 1) Se caracterizó a los RP-BZDs de diferentes tejidos de la rata por fijación de ³H-RO 5-4864. 2) Cationes divalentes como Ca²+, Co²+ y Cd²+ modulan la fijación de ³H-RO 5-4864, sin alterar la unión de antagonistas. Esta regulación es temperatura dependiente. Algunos lípidos modulan al RP-BZD como el AA, el cual muestra un efecto similar al calcio. Estudios futuros podrían estudiar más detalladamente tal interacción. 3) Productos farmacológicos o de origen natural como el etanol o los flavonoides reconocen con potencia variada a los RP-BZDs. 4) Se purificó parcialmente una fraccion capaz de desplazar la fijación de ³H-RO 5-4864 con Rf similar a algunas Pfs naturales. Se especula sobre la posible existencia de ligandos endógenos fisiológicos del RP-BZD. 5) Se estudió la localización subcelular de los RP-BZD en células intersticiales testiculares y se los caracterizó farmacológicamente. Los RP-BZDs resultaron estar especialmente concentrados en las mitocondrias de este tipo celular. Regulación de los RP-BZDs: 1) Durante el stress agudo aumenta la densidad de RP-BZDs en riñón y bulbo olfatorio. 2) El tratamiento crónico con BZDs regula diferencialmente las propiedades de los RP-BZD en distintos tejidos. 3) El tratamiento crónico con etanol modula las propiedades de los RP-BZD. Función de los RP-BZDs: 1) Se seleccionó un modelo experimental para el estudio de la función de los RP-BZDs: celulas testiculares de Leydig. Se propone y discute el rol de las BZDs periféricas sobre la respuesta esteroidogénica. El RO 5-4864 provoca una estimulación de la producción basal o hCG inducida de testosterona. 2) La disminución en el número de RP-BZDs resultado del tratamiento crónico con diazepam correlaciona con una reducción marcada en la estimulación de la produccion de testosterona por RO 5-4864.

La activación del receptor GABAA durante un breve período de tiempo (5-10 minutos) por GABA, en neuronas de corteza cerebral de rata, induce horas más tarde una reducción en la interacción entre los sitios de unión de GABA y benzodiacepinas, llamada desacoplamiento, en ausencia de cambios en el número de receptores. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el mecanismo molecular del desacoplamiento inducido por GABA. Nuestros resultados sugieren que el desacoplamiento inducido por GABA está asociado a una reducción en el porcentaje de receptores GABAA conteniendo la subunidad α3. Por otro lado, los resultados de nuestros experimentos indicarían que el desacoplamiento está también mediado por un aumento en el grado de fosforilación de la subunidad γ2 del receptor. Por lo tanto, el desacoplamiento sería el resultado de al menos dos mecanismos regulatorios que actuando en forma conjunta producen una alteración adaptativa en la función del receptor GABAA. Si bien no se conocen las vías de señalización intracelulares activadas, es posible que un aumento en la internalización del receptor GABAA inducido por GABA represente la señal que desencadenaría los procesos responsables del desacoplamiento.

Fil:Páez Pereda, Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Cambios en la tasa de elongación de la ARN polimerasa II (pol II) modulan los patrones de splicing alternativo, debido a que afectan el tiempo en el cual los sitios de splicing del pre- ARNm naciente son presentados a la maquinaria de splicing (un efecto conocido como acoplamiento cinético). Mostramos aquí un nuevo exón alternativo que responde a la elongación de la pol II: el exón 18 de la molécula de adhesión celular neural (NCAM), cuya inclusión es regulada durante la diferenciación y la plasticidad sináptica. Buscando estímulos que afecten al splicing alternativo a través de su acoplamiento cinético con la transcripción, encontramos que la despolarización del potencial de membrana de células neuronales provoca la exclusión del exón 18 del ARNm maduro. El efecto se observa tanto en cultivos primarios de neuronas hipocampales como en una línea de neuroblastoma murino, y es independiente de la vía de las kinasas dependientes de calcio/calmodulina (CaMKs). Un análisis de los niveles de modificaciones de histonas a lo largo del locus endógeno de Ncam revela una disminución local de marcas asociadas a transcripción activa y elongación de la pol I I, como tri-metilación de H3K36 y acetilación de histonas, en la vecindad del exón 18. El tratamiento de despolarización afecta la cromatina de este gen en forma específica, causando un incremento en acetilación de H3K9 en una región interna que incluye a este exón alternativo. Esta acetilación intragénica está asociada a mayor apertura de la cromatina, mayor procesividad de la pol II y tri-metilación de H3K36 en esta región, pero no es acompañada por cambios en el promotor del gen. En base a los resultados de la tesis presentamos un modelo donde la excitación neuronal dispara cambios en la estructura de la cromatina intragénica del gen de NCAM, que facilita la elongación de la pol II en esta región y subsecuentemente causa la exclusión del exón 18 del ARNm. Este modelo señala un rol fisiológico de la modulación de la cromatina intragénica en la biogénesis de los ARNm en las células eucariotas.

Como organismos sésiles, las plantas superiores se caracterizan por un alto grado de plasticidad en el desarrollo en respuesta a las señales ambientales, optimizando así sus funciones de una manera que maximiza sus posibilidades de supervivencia y reproducción. Son capaces de detectar la calidad, cantidad y dirección de la luz, y utilizarla como una señal externa para optimizar su crecimiento. Por otra parte, el splicing alternativo es un mecanismo esencial para aumentar la plasticidad del transcriptoma que juega importantes roles en varios aspectos del desarrollo de los metazoos. Sin embargo, poco se conoce del proceso en plantas y de las consecuencias del mismo. Aquí demostramos que el splicing alternativo de varios genes de Arabidopsis thaliana está regulado por transiciones de luz/oscuridad. Para el caso particular de RSp31 (un gen que codifica para una proteína reguladora de splicing o SR) es la intensidad de la luz incidente la que tiene un efecto directo sobre su transcripción y procesamiento. El cloroplasto percibe la luz y genera una señal (retrógrada) capaz de viajar por la planta que provoca los cambios observados en la abundancia relativa de isoformas de RSp31. Las plastoquinonas, componentes de la cadena de transporte electrónico fotosintético, serían un lugar de integración de diferentes señales y una pieza clave en la respuesta de RSp31 a la luz. Por otra parte, demostramos que la metil‐transferasa de proteínas PRMT5 es un importante regulador del proceso de splicing alternativo en Arabidopsis thaliana y está involucrada en la generación de respuestas circadianas en esta planta. Reunimos evidencia que apunta a un efecto sobre el reconocimiento de los sitios dadores (5’ss) de splicing en el mecanismo por el cual PRMT5 ejerce su modulación sobre el proceso de splicing alternativo. Tal mecanismo estaría conservado en Drosophila melanogaster. En este organismo, al igual que en Arabidopsis, PRMT5 regula la expresión y los patrones de splicing alternativo de numerosos genes. Sin embargo, si bien controla la actividad locomotora (una respuesta mediada por el reloj), su vínculo con el oscilador central es más difuso.

El splicing alternativo amplía las posibilidades de expresión génica a partir de un número limitado de genes. El splicing está funcionalmente acoplado a la transcripción, y la velocidad de elongación de la ARN Polimerasa II (Pol II) regula algunos eventos de splicing alternativo. Se postula que una menor velocidad de elongación favorece el reconocimiento de sitios débiles por la maquinaria de splicing antes de la síntesis de sitios fuertes competidores río abajo. El exón alternativo EDI de fibronectina está río abajo de un sitio 3’ subóptimo y su inclusión aumenta en situaciones de baja elongación; esto puede deberse a que el reconocimiento del sitio débil antes de la síntesis del sitio fuerte en el intrón siguiente lleva a la escisión del intrón con el sitio débil, forzando la posterior inclusión. Aplicamos una estrategia para estudiar del orden de remoción de los intrones que rodean a un exón determinado. Estudiamos un exón con inclusión reprimida por elongación (EDI), un exón que baja su inclusión a menor elongación (CFTR9), un exón alternativo que no responde a elongación (EDII) y un exón constitutivo (E28). El orden de remoción de intrones se modifica según la línea celular, la presencia de mutaciones en cis o la abundancia diferencial de factores reguladores, pero no se modifica por cambios en la elongación asociados a cambios en la inclusión de EDI. Los resultados sugieren un nuevo mecanismo de regulación de la inclusión de CFTR9 y nos obligan a replantearnos nuestro modelo de regulación cinética de EDI. Aplicamos un método para medir la elongación de Pol II in vivo en genes particulares, y comprobamos que la camptotecina baja la velocidad de transcripción de fibronectina. Medimos el reclutamiento de U2AF65 al sitio débil de EDI y al sitio fuerte río abajo en células tratadas con camptotecina y en células control y observamos un aumento de la unión de U2AF65 al sitio débil con respecto a la unión al sitio fuerte en las células tratadas. Comprobamos así que una menor elongación favorece el reconocimiento por la maquinaria de splicing del sitio débil a expensas del sitio fuerte, y la posterior inclusión del exón independientemente de la cinética de remoción de intrones.

La luz es un estímulo ambiental que regula varios procesos biológicos en las plantas. A través del cloroplasto, la luz regula el splicing alternativo de un conjunto de genes. En este trabajo nos propusimos estudiar los mecanismos por los que la luz realiza esta regulación. Tomamos como modelo el gen RS31, que codifica para un factor de splicing rico en serinas y argininas. Encontramos que los cambios que se observan en las isoformas de RNA mensajero de RS31 por acción de la luz se deben al proceso de splicing alternativo y no a una degradación diferencial de sus isoformas. Por otro lado, encontramos que el tratamiento de plantas que se encuentran en oscuridad con tricostatina A, una droga que promueve la hiperacetilación de histonas, imita el efecto de la luz sobre el splicing alternativo. Además, demostramos que una mutante de Arabidopsis deficiente en la deacetilación de histonas HD1 muestra un menor efecto de luz a oscuridad que las plantas salvajes. El efecto de la luz sobre el splicing alternativo implica cambios en la elongación de la transcripción: el tratamiento de plantas con camptotecina, droga que inhibe la elongación, imita el efecto de la oscuridad sobre el splicing alternativo. Realizamos mediciones de la tasa de elongación y encontramos que en luz la elongación es más rápida que en oscuridad en el gen de RS31. Finalmente, en plantas de Arabidopsis defectuosas en el factor de elongación TFIIS el efecto de la luz sobre el splicing alternativo de los eventos estudiados se inhibe por completo. Estos resultados muestran que el efecto de la luz sobre el splicing alternativo depende de cambios en la elongación de la transcripción.

Fil:Judewicz, Norberto D.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La rama gruesa ascendente del asa de Henle reabsorbe el 30% del cloruro de sodio (NaCl) filtrado por el glomérulo. Aproximadamente 60% del ión sodio (Na+) es reabsorbido a través del transporte activo transcelular. Como resultado del transporte activo de solutos, existe un voltaje luminal positivo en esta segmento, que favorece la reabsorción del Na+ restante a través de la vía paracelular. El óxido nítrico (NO) promueve natriuresis y diuresis, en parte debido a la inhibición del transporte de solutos en la rama gruesa ascendente del asa de Henle. Se sabe que el NO inhibe la reabsorción transcelular de sal, pero se desconocen sus efectos sobre la vía paracelular. Para evaluar el efecto del NO en la selectividad de esta última, comenzamos por medir los potenciales de dilución causados por la reducción de la concentración de NaCl en la solución del baño basolateral a 64/56, 32/24 ó 16/8 mM Na+/Cl- en túbulos de la rama gruesa ascendente del asa de Henle aislados y perfundidos. A partir de los diferentes potenciales de dilución calculamos el radio de permeabilidad Na+/Cl- (PNa+/PCl-). Dicho radio es una medida de permeselectividad paracelular, y encontramos que era ~2 en todos los casos. Estos datos indican que la vía paracelular en este segmento del nefrón es más selectiva para Na+ que para el ión cloro (Cl-) por un factor de 2, e indican que el transporte transcelular no se alteró de manera significativa por la dilución de NaCl en el baño basolateral. En los experimentos siguientes empleamos la solución conteniendo 32/24 mM de Na+/Cl-. Al utilizar dos dadores de NO químicamente distintos o el sustrato para la producción endógena de NO, L-arginina, se observó una disminución de PNa+/PCl-. Estos resultados demuestran que NO tiene un efecto sobre la selectividad de la vía paracelular, pero no indican específicamente cómo las permeabilidades absolutas de cada ión se ven afectadas. Para investigar el efecto del NO sobre PNa+ y PCl- individualmente, es necesario medir tanto PNa+/PCl- como la resistencia transepitelial (Rt). La Rt refleja solamente las vías de transporte conductivas y, en la rama gruesa ascendente del asa de Henle, representa mayormente la resistencia de la ruta paracelular. Bajo condiciones control, el valor de Rt hallado fue 7700 ohm-cm. Cuando se agregó L-arginina, la Rt disminuyó, y dicho efecto fue bloqueado por el inhibidor de NOS, L-NAME. Estos resultados demuestran que el NO disminuye la función de “barrera” de la ruta paracelular. A continuación medimos una vez más el efecto del NO producido de manera endógena sobre los potenciales de dilución y PNa+/PCl-. Con estos datos y los valores de Rt obtenidos, calculamos PNa+ y PCl- individualmente, hallando que el NO incrementó PNa+ un 40% y PCl- un ~100%. La mayoría de las acciones del NO en el túbulo proximal y la rama gruesa ascendente del asa de Henle están mediadas por guanosín monofosfato cíclico (GMPc). Es por esto que investigamos si este segundo mensajero está mediando los efectos del NO sobre la vía paracelular observados en nuestro modelo. El GMPc disminuyó PNa+/PCl- y Rt, provocando el aumento de PNa+ y PCl- de manera similar al NO. Estos datos sugieren que GMPc está mediando el efecto final del NO sobre las permeabilidades absolutas. El GMPc puede activar dos mediadores posteriores en la vía de señalización, la proteína quinasa dependiente de GMPc (PKG) y la fosfodiesterasa 2 (PDE2). Por lo tanto, evaluamos cuál de ellos está mediando las acciones del NO. En presencia del inhibidor de PKG, KT5823, el dador de NO no tuvo efecto significativo sobre el potencial de dilución. En contraste, cuando repetimos este experimento utilizando un inhibidor de PDE2, el dador de NO disminuyó el potencial de dilución, de manera similar a lo descripto anteriormente para aquellos experimentos donde solamente utilizamos un dador de NO. Estos datos indican que PKG, y no PDE2, es el mediador del efecto del NO sobre la ruta de transporte paracelular. La Rt y la selectividad iónica de la vía paracelular están reguladas por una familia de proteínas llamadas claudinas. La rama gruesa ascendente del asa de Henle expresa claudina-19, que ha sido anteriormente relacionada con la regulación de la permeabilidad de Na+. Además, la claudina-19 puede formar combinaciones heteroméricas y heterotípicas con las claudinas-3 y -16 en este segmento. Para evaluar si los efectos de NO sobre la vía paracelular están mediados por un poro del cual al menos la claudina-19 forma parte, medimos los potenciales de dilución en presencia o ausencia de un anticuerpo contra un dominio extracellular de la claudina-19 o contra la proteína Tamm-Horsfall (control). Cuando el anticuerpo anti-claudina-19 estaba presente, ni el dador de NO, ni el sustrato para la producción endógena de NO -L-arginina- tuvieron efecto sobre los potenciales de dilución. En presencia del anticuerpo anti-Tamm-Horsfall, el dador de NO disminuyó el potencial de dilución. Estos datos sugieren que los efectos del NO sobre la vía paracelular son mediados por un poro formado al menos por una unidad de la claudina-19. Finalmente, modelamos matemáticamente el efecto del NO sobre la concentración luminal de Na+ a lo largo de la rama gruesa ascendente del asa de Henle basándonos en nuestros resultados. Bajo condiciones control, en ausencia de NO, la concentración luminal de Na+ decae exponencialmente a 22.4 mM al final de dicho segmento. Cuando consideramos el efecto del NO sobre la vía paracelular únicamente, la concentración luminal de Na+ al final del túbulo es 33.9 mM, más alta que en control, indicando que se absorbe menos Na+. Al tener en cuenta el efecto del NO sobre la vía transcelular solamente, la concentración luminal de Na+ al final del túbulo es 46.2 mM, y al considerar su efecto sobre ambas vías combinadas, 52.5 mM. Por lo tanto, el efecto del NO sobre la ruta paracelular provoca una reducción en la reabsorción neta de Na+. La magnitud de dicha reducción es similar a aquella resultante de NO actuando sobre la ruta transcelular, pero el efecto del NO sobre ambas vías combinadas tiene una dinámica de antagonismo.