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Tesis para obtener el grado de Magister en Floricultura, presentada en la Universidad Nacional de Lomas de Zamora en octubre de 2015

La endometriosis se caracteriza por la presencia de focos de tejido endometrial por fuera de la cavidad uterina confiriéndole, a las mujeres que la padecen, fuertes dolores pélvicos e infertilidad. Basándonos en trabajos previos realizados en cáncer, evaluamos la aplicación de los inhibidores de aromatasa, los inhibidores de ciclooxigenasa (COX)-2 y los agonistas de los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR)γ como posibles alternativas terapéuticas para la endometriosis. Específicamente evaluamos los efectos del inhibidor de aromatasa, anastrozole, del inhibidor selectivo de COX-2, celecoxib y del ligando de PPARγ, rosiglitazona sobre el crecimiento de células endometriales in vitro y sobre la implantación y crecimiento de lesiones endometriósicas en un modelo murino de endometriosis. Los resultados obtenidos son promisorios ya que todos los tratamientos provocaron efectos inhibitorios del desarrollo de la endometriosis así como efectos antiproliferativos, proapoptóticos y antiangiogénicos tanto in vivo como in vitro. Por otro lado, luego de administrar anastrozole y celecoxib en forma conjunta, no pudimos demostrar una mejora del tratamiento combinado por sobre la aplicación de cada una de las terapéuticas de manera individual. Nuestros resultados avalan al inhibidor de COX-2 como una alternativa terapéutica concreta para la endometriosis y, sugieren que la combinación de celecoxib con una glitazona podría mejorar la involución de la endometriosis, aunque aún se requiere profundizar los estudios para confirmar estos últimos datos.

A modo de resumen final detallaremos los puntos principales que se han desarrollado en esta tesis: a- Producción de factores estimuladores del crecimiento tumoral por el bazo de ratones portadores de tumor. b- Relación entre Factores exacerbadores tumoral y el tamaño del tumor. c- Caracterización parcial de las fracciones con actividad exacerbadora. d- Poblaciones esplénicas que intervienen en el fenómeno de exacerbación tumoral. e- Neutralización de la actividad exacerbadora por sueros inmunes xenogeneicos. f- Relación de la actividad exacerbadora con factores circu- lantes como los CIC. g- Angiogénesis inducida por linfocitos, correlación con la exacerbación tumoral.

El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de la administración de un agonista de Gn-RH (Acetato de Leuprolide, LA) sobre la apoptosis y la esteroidogénesis ovárica. Se administró dietilestilbestrol (DES) a ratas prepúberes para obtener una población de folículos antrales tempranos. Por otro lado, se utilizó un modelo de ratas inmaduras superovuladas con gonadotrofinas (PMSG: gonadotrofina de suero de yegua preñada) con el objetivo de estimular la foliculogénesis hasta el estadío de folículos preovulatorios; parte de estos animales fueron tratados in vivo con LA tanto en forma crónica como aguda. En folículos preovulatorios, LA produce un efecto directo inhibitorio sobre el desarrollo folicular, causando una disminución del número de folículos reclutados por las gonadotrofinas o bien llevando a la atresia a un mayor número de los mismos. Tanto el efecto in vivo como in vitro de LA produce un aumento de la apoptosis en los folículos preovulatorios provenientes de ratas tratadas con PMSG y este efecto es revertido parcialmente in vitro por EGF. El IGF-1 y el FGF fueron capaces de inhibir completamente el efecto estimulatorio de la apoptosis inducida por el agregado in vitro de LA. Con respecto a la familia de Bcl-2, LA disminuye la estabilidad de la isoforrna antiapoptótica (Bcl-xL), favoreciendo la apoptosis. LA aumenta los niveles de progesterona tisular y disminuye los niveles de estradiol sérico; no modifica los niveles de la enzima P450 scc pero aumenta el contenido de la StAR en folículos preovulatorios. En folículos antrales tempranos, FSH suprime parcialmente la apoptosis inducida por LA. En presencia del agonista, EGF, FGF e IGF-1 no son capaces de rescatar a los folículos de la apoptosis. Teniendo en cuenta las diferencias entre el efecto de FSH y los factores de crecimiento, se sugiere la existencia de un mecanismo complejo de transducción de señales para FSH en la prevención de la apoptosis que utilizaría un mecanismo de sobrevivencia que incluye señales diferentes a las usadas por los factores de crecimiento. En conclusión, GnRH-a sería un modulador atretogénico intraovárico que interfiere en el desarrollo folicular.

El objetivo de esta tesis es el estudio de factores regulatorios, de producción y acción local, que controlan el desarrollo del folículo ovárico en mamíferos. En particular, se estudió el papel fisiológico de factores relacionados con el factor de crecimiento transformante-β (TGF-β).El modelo utilizado consistió en células de la granulosa inmaduras de rata cultivadas en condiciones definidas. Se determinó que las células de la granulosa producen TGF-β bioactivo, encontrándose su secreción bajo control hormonal. El TGF-β producido ejerce acciones autocrinas, estimulando el crecimiento de células de la granulosa. La activina, otro miembro de la misma superfamilia, también es producida por las células de la granulosa y regula positivamente la proliferación de manera significativamente mayor que la realizada por el TGF-β. Factores paracrinos derivados del ovocito, probablemente pertenecientes a la misma superfamilia, promueven el crecimiento de las células somáticas del folículo, indicando que el ovocito participa activamente en el desarrollo folicular. Las acciones mitogénicas del TGF-β, activina o del factor derivado del ovocito sobre las células de la granulosa, son amplificadas por bajas concentraciones de FSH, enfatizando la potencial relevancia de estos factores sobre la función ovárica. Asimismo, estos factores locales ejercieron un regulación diferencial de la producción de inhibinas A y B, llevando la relación entre las formas hacia la predominacia de inhibina B, de manera semejante a lo encontrado in vivo en los estadios de crecimiento folicular. Estos resultados indican que factores intraováricos, relacionados con el TGF-β, juegan un papel importante en el desarrollo folicular, regulando el crecimiento y la diferenciación de las células de la granulosa.

El desarrollo sexual en la rata macho es un proceso complejo que involucra interacciones entre el hipotálamo, hipófisis, testículo y órganos sexuales accesorios. El propósito de esta Tesis ha sido estudiar la influencia de los andrógenos sobre distintos aspectos de la regulación del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal en la rata macho, resaltando la importancia de estos eventos durante el desarrollo sexual. Se evaluaron las posibles alteraciones en el perfil hormonal en suero en la rata macho prepúber, originadas por el bloqueo de la acción androgénica a través de la administración de los antiandrógenos flutamida y casodex. Se analizó también el efecto de estos antiandrógenos sobre la función testicular y el trofismo epididimario. Se caracterizaron las distintas isoformas de FSH hipofisaria en la rata macho, de acuerdo a la estructura interna de los oligosacáridos unidos al polipéptído, mediante la separación de las mismas por cromatografía en concanavalina A. Se estudió la influencia de la edad y del entorno androgénico sobre la heterogeneidad de FSH, en términos de inmuno y bioactividad. Estos resultados contribuyen al conocimiento de los mecanismos de regulación de los andrógenos sobre el eje reproductivo en la rata macho, los cuales se manifiestan a través de una amplia diversidad de efectos sobre los distintos niveles que conforman el eje.

El factor de transcripción maestro GATA3 se encuentra involucrado en el desarrollo de la glandula mamaria y es requerido para el mantenimiento del estado diferenciado de las células epiteliales luminales. El rol de GATA3 en cáncer de mama como supresor tumoral ha sido establecido, a pesar de que el mecanismo de la pérdida de expresión de GATA3 es no ha sido descrito hasta el momento. En el presente trabajo, demostramos que la activación del Receptor de Progesterona (RP) promueve el co-reclutamiento de la metiltransferasa de histonas Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2) río arriba del locus de GATA3, incrementando los niveles de trimetilación de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3) e induciendo la compactación de la cromatina, lo cual resulta en la disminución de los niveles del ARNm de GATA3. Esta regulación se encuentra acoplada a una disminución de la estabilidad de la proteína GATA3, mediante la fosforilación inducida por progestágenos en el residuo serina 308 (pSer308-GATA3), seguida por degradación vía proteasoma 26S. Ambos mecanismos moleculares convergen para lograr reducir la expresión de GATA3 en células de cáncer de mama tras la activación del RP. Además, demostramos que la reducción en los niveles de GATA3 es requerida para lograr el incremento inducido por progestágenos de la ciclina A2, la cual media la transición de la fase G1 a S del ciclo celular, y se encuentra asociada a un peor pronóstico en pacientes de cáncer de mama. Finalmente, demostramos que la disminución de los niveles de GATA3 son necesarios para la proliferación celular in vitro y el crecimiento tumoral in vivo inducidos por progestágenos.

Las células NK son células del sistema inmune, críticas en la defensa contra células tumorales y células infectadas, que se activan luego de sensar señales a través de receptores activadores y por acción de citoquinas secretadas por macrófagos y células dendríticas (CD), entre las cuales IL-12 es considerada una de las más relevantes. Recientemente se han descripto nuevos miembros de la familia de IL-12, entre ellos IL-23 e IL-27. IL-23 posee efectos pro-inflamatorios, pero existen datos contradictorios en cuanto a su rol en el contexto tumoral. En cambio, IL-27 induce una potente respuesta anti-tumoral, pero posee efectos tanto pro- como anti-inflamatorios. Debido a que el efecto de estas citoquinas sobre las células NK humanas aún no ha sido investigado, el objetivo de esta tesis doctoral fue estudiar el efecto de IL-23 e IL-27 sobre estas células. En primer lugar, demostramos que IL-23 e IL-27 secretadas por CD contribuyen a estimular la producción de IFN-γ por células NK. Mediante el empleo de inhibidores farmacológicos, demostramos que la estimulación de células NK con las citoquinas recombinantes indujo la producción de IFN-γ a través de la activación de las vías de JNK, PI3K, MEK1/2, NF-κB y mTOR, y que IL-27 activó además a STAT-1. Observamos también que tanto IL-23 como IL-27 generaron un efecto de priming para IL-18, exhibiendo estas citoquinas un efecto sinérgico con IL-18 para la secreción de IFN-γ. En el caso de IL-27, dicho efecto involucró un aumento en la expresión de T-bet y del receptor de IL-18. A su vez, ambas citoquinas indujeron un aumento en la expresión de los marcadores de activación celular CD25 y CD69, y potenciaron la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. IL-27, pero no IL-23, estimuló la respuesta citotóxica de las células NK de manera dependiente de NKp46 y de las vías de NF-κB y mTOR, a través de la vía secretoria y de TRAIL, pero no la de FasL. Detectamos además que IL-18 potenció la actividad citotóxica inducida por IL-27 a través de la inducción de un aumento en la expresión de ICAM-1 en las células blanco mediado por IFN-γ. En conjunto estos resultados indican que IL-23 e IL-27 estimulan las funciones efectoras de las células NK, lo que puede ser relevante durante situaciones tanto fisiológicas como patológicas.

Fil:Chelala, César A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Streptomyces es un género bacteriano caracterizado por poseer un complejo ciclo de vida que involucra varios pasos de diferenciación fisiológica y morfológica. Durante su desarrollo, las bacterias de este género suelen producir una amplia gama de metabolitos con actividad biológica, que han sido tradicionalmente utilizados como antibióticos, antiparasitarios, antifúngicos, anticancerígenos, entre otros. Sin embargo, los Streptomyces son capaces también de sintetizar y acumular triglicéridos (TAG) como reserva de energía y carbono. Esta característica, si bien es inusual en bacterias, es compartida con otros géneros del orden de los Actinomicetales como Rhodoccocus, Nocardia y Mycobacterium. A pesar de su diversificado metabolismo lipídico, los estudios en el género Streptomyces se han concentrado generalmente en el área de la producción de metabolitos secundarios, y muy poco se conoce acerca de cómo este organismo sintetiza sus ácidos grasos y regula su flujo hacia fosfolípidos o TAG. Además, en S. coelicolor la síntesis de ácidos grasos y del metabolito secundario actinorrodina comparten un precursor clave, el malonil-CoA, lo que plantea un complejo escenario regulatorio para la síntesis de estos compuestos carbonados en este microorganismo. Así, como objetivo general de este trabajo de tesis nos propusimos identificar y caracterizar los mecanismos genéticos y bioquímicos que regulan la síntesis de ácidos grasos y lípidos de reserva en Streptomyces coelicolor. Para ello, en una primera etapa nos centramos en la caracterización de un regulador transcripcional de la síntesis de ácidos grasos en esta bacteria, FasR, con el fin de develar su rol fisiológico y entender de qué manera lleva a cabo su función regulatoria. Demostramos, mediante experimentos genéticos y bioquímicos, que FasR es un activador transcripcional del operón fab (fabD-fabH-acpP-fabF), el cual codifica para las proteínas esenciales del sistema de sintasa de ácidos grasos de tipo II de este organismo. FasR lleva a cabo su función uniéndose directamente a la región corriente arriba del operón fab, y su actividad estaría modulada por algún metabolito relacionado con el metabolismo de lípidos. A continuación nos planteamos identificar el paso enzimático que genera el diacilglicerol (DAG), un sustrato clave para la síntesis de TAG. A pesar del rol que juegan estas moléculas en las diferentes especies como reserva de energía y carbono, la ruta de abastecimiento de DAG para su síntesis es completamente desconocida en bacterias. En este apartado trabajamos bajo la hipótesis de que enzimas fosfatidato fosfatasas de tipo 2 (PAP2) serían las responsables de defosforilar al intermediario ácido fosfatídico y generar así el DAG necesario para la síntesis de TAG. A través de análisis informáticos fuimos capaces de identificar tres probables proteínas con actividad PAP. El posterior estudio de las mismas reveló que sólo dos de ellas, Lppα y Lppβ, eran capaces de defosforilar fosfatidato in vitro y tenían además un rol en el metabolismo lipídico de S. coelicolor. Una cepa mutante en ambos genes presentó niveles reducidos de TAG a tiempos cortos de crecimiento, equiparándose con los niveles de la cepa salvaje a tiempos mayores. Estas evidencias indican que si bien tanto Lppα como Lppβ estarían proveyendo DAG para la síntesis de TAG en S. coelicolor, existen en este organismo rutas alternativas de generación de DAG que prevalecen a tiempos largos de cultivo. Por último, con la información obtenida a partir de estos estudios básicos se reconstituyó la vía de síntesis de TAG en la bacteria no oleaginosa E. coli como prueba de concepto acerca de la funcionalidad de los genes caracterizados en la vía de síntesis de TAG en S. coelicolor. Para ello se utilizó como hospedador una cepa de E. coli ΔdgkA, que posee una deleción en el gen que codifica para una DAG quinasa capaz de reciclar el DAG hacia la síntesis de fosfolípidos. En este contexto se expresaron en forma heteróloga las enzimas fosfatidato fosfatasa Lppβ y DAG aciltransferasa Sco0958, que catalizan los dos últimos pasos de la síntesis de TAG. Si bien la sola expresión de Sco0958 demostró ser suficiente para la síntesis de TAG en este contexto genético, la expresión adicional de la fosfatasa Lppβ tuvo un efecto positivo en el contenido de TAG, confirmando su capacidad de generar el sustrato DAG limitante para la síntesis de TAG. Luego de una optimización de la cepa de E. coli productora de TAG, y de su cultivo en sistemas de alta densidad, fuimos capaces de obtener una producción de 722,1 mg TAG/L, lo que constituye el mayor título de TAG reportado para E. coli recombinantes en la literatura. En conjunto, estos resultados muestran cómo las evidencias que surgen a partir de estudios básicos pueden volcarse en el campo aplicado para resolver una necesidad particular. Sin embargo, a pesar de lograr el mayor título de TAG reportado hasta el momento para E. coli, es necesario aún incrementar la productividad volumétrica de TAG en este sistema para lograr el establecimiento de este huésped heterólogo como futura plataforma de biosíntesis de lípidos neutros aptos para la producción de, por ejemplo, biocombustibles.