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Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015

Las plantas utilizan la luz no sólo como fuente de energía en la fotosíntesis sino también como fuente de información del ambiente circundante. Las señales lumínicas pueden ser percibidas por las plantas si estas poseen receptores adecuados. El fitocromo (phy) es un fotorreceptor que actúa principalmente en la región del espectro del R (rojo) y RL (rojo lejano). En Arabidopsis thaliana hay cinco fitocromas (phyA-phyE). Las señales lumínicas percibidas por los fitocromos afectan el crecimiento y desarrollo de las plantas durante todo el ciclo de vida. Una de las características distintivas de las respuestas a la luz está dada por los cambios en la sensibilidad que se producen en distintos contextos del desarrollo. El objetivo de esta tesis es identificar los mecanismos involucrados en la regulación de la sensibilidad a la luz, mediante la caracterización fisiológica y genética de mutantes de Arabidopsis thaliana para comprender las implicancias de las alteraciones en su capacidad de respuesta a la luz. En esta tesis se caracterizaron nuevos componentes genéticos de la regulación de la sensibilidad de las respuestas a la luz mediadas por el phyA, que actúa en dos vías de señalización VLFR y HIR. Algunos de los mutantes estudiados fueron encontrados por su efecto sobre la acción del phyA, pero no se sabía si afectaban el VLFR y/o HIR como el mutante spa1. Otros eran conocidos porque presentaban morfología alterada en la planta adulta o defectos en el tiempo a floración pero no habían sido vinculados al phyA como el cp3 y gi5. Finalmente el eve2 es un nuevo locus identificado en esta tesis. Los resultados de esta tesis muestran que los mutantes cp3, spa1 y eve2 presentan alta sensibilidad a la luz. El mutante cp3 presenta un VLFR aumentando sin afectar el HIR en la señalización del phyA. El mutante spa1 aumenta tanto las respuestas VLFR como las HIR pero el efecto de la mutación es mucho más pronunciado en el VLFR. El mutante eve2 aumenta las respuestas VLFR y si bien presenta HIR normal afecta la transición del VLFR al HIR; eve2 presenta un efecto más generalizado que el resto de los mutantes estudiados ya que afecta de alguna manera las señales mediadas por otros fotorreceptores. El CP3, SPA1 y EVE2 serían componentes negativos en la señalización del phyA. El mutante gi, presenta atenuadas las respuestas en el VLFR y esto sugiere que actuaría como un regulador positivo en la señalización del phyA. Debido a la participación de GI en los ritmos circadianos y en la inducción de la floración por la vía fotoperíodica, estudiamos el efecto de la mutación en el ritmo de la sensibilidad a la luz por parte del phyA. Los resultados muestran que el efecto del GI en la señalización del phyA sería independiente de su rol en el reloj. La versatilidad en las respuestas mediadas por el phyA pone de manifiesto la existencia de finos mecanismos de regulación que les permiten a las plantas responder en forma precisa a las señales del ambiente lumínico y en virtud de esa información ajustar el crecimiento y desarrollo ignorando cambios del ambiente que no constituyan verdaderas señales.

Entre las enfermedades infecciosas, la tuberculosis (TB) continúa siendo una de las principales causas de muerte entre los adultos. Algunos años atrás se pensó que esta enfermedad estaba controlada y que sería erradicada a mediano plazo. Sin embargo, hoy en día la TB está restablecida debido a diversos factores, entre ellas la aparición del SIDA. Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la tuberculosis, presenta una pared celular inusual, característica de todas las micobacterias. Esta envoltura celular resulta esencial para la viabilidad y supervivencia de las mismas en ambientes hostiles y consiste de una capa altamente impermeable de ácidos micólicos de 70-90 átomos de carbono unidos covalentemente al peptidoglicano (PG) a través de un polisacárido conector, el arabinogalactano (AG). Los ácidos micólicos son los componentes mayoritarios de la envoltura celular de las micobacterias y juegan un rol crucial en su compleja arquitectura y en su impermeabilidad. La biosíntesis de los ácidos micólicos requiere de dos tipos de sintasas de ácidos grasos (FAS): la enzima multifuncional FAS-I, similar a la presente en eucariotas, y el sistema dependiente de la proteína transportadora de acilos (ACP), FAS-II, el cual consiste de una serie de enzimas donde cada una cataliza un paso en la vía de elongación de acil-CoAs de cadena mediana C12-C16, previamente sintetizados por FAS-I. Los componentes genéticos del sistema FAS-II han sido identificados en M. tuberculosis y se encuentran agrupados en tres unidades transcripcionales principales: fabD-acpM-kasA-kasB-accD6 (operón fasII), mabA-inhA y hadA-hadB-hadC. Análisis de microarreglos demostraron que el tratamiento de M. tuberculosis con diversos antibióticos que afectan la síntesis de ácidos micólicos, como isoniacida (INH), etionamida (ETH) o tiolactomicina (TLM), inducen la transcripción de los genes de operón fasII. A su vez fas, el gen que codifica para la enzima multifuncional FAS-I, también se induce tras el tratamiento de M. tuberculosis con INH, sugiriendo la existencia de señales regulatorias comunes a los dos sistemas FAS. Esta información junto al concepto general sobre la existencia de sistemas reguladores que controlan la homeostasis lipídica en la mayoría de los organismos, llevó a que nuestro grupo de investigación se propusiera estudiar quién y cómo se regulan a nivel transcripcional los sistemas de síntesis de ácidos grasos en micobacterias. Es así que fuimos capaces de identificar y caracterizar una proteína reguladora del operón fasII, a quien llamamos MabR (por sus siglas en inglés, Mycolic acid biosynthesis Regulator). Los resultados de esta investigación representaron la primera caracterización de un regulador clave para el metabolismo de ácidos grasos en M. tuberculosis y sentaron las bases para el desarrollo del trabajo de tesis aquí presentado. Los estudios de microarreglos y proteómica antes detallados, junto con la evidencia de que la transcripción del gen fas se veía afectada cuando alterábamos los niveles fisiológicos de MabR, sugirieron la existencia de un mecanismo de regulación coordinado entre los dos sistemas FAS mediado por MabR. La identificación de una repetición invertida en la secuencia promotora del gen fas, similar a la reconocida por MabR en la región promotora del operón fasII, nos llevó a pensar que MabR podría estar regulando de manera directa la transcripción del mismo. Sin embargo, la incapacidad de evidenciar esta interacción in vitro nos condujo a la búsqueda de un nuevo regulador transcripcional del sistema FAS-I. Para alcanzar los objetivos propuestos, en el presente trabajo de tesis se caracterizó la región promotora del gen fas de M. tuberculosis y Mycobacterium smegmatis, comprobando que este gen forma parte de un operón al que denominamos operón fas-acpS. Se identificó y purificó una proteína reguladora de dicho operón, denominada FasR (por sus siglas en inglés, Fatty acid synthase Regulator), la cual fue caracterizada mediante diversos análisis bioquímicos y genéticos. Pudimos determinar que FasR se une a tres repeticiones de una secuencia operadora conservada, en la región promotora del operón fas-acpS. Estudios in vitro e in vivo demostraron que FasR es un activador transcripcional esencial en M. smegmatis, cuya afinidad por la región promotora del operón fas-acpS es modulada por acil-CoAs de cadena larga, productos del sistema FAS-I. La mayoría de los experimentos realizados en este trabajo de tesis utilizaron a M. smegmatis como sistema modelo, elección que responde a razones prácticas. En conclusión, los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis, junto con aquellos previamente publicados por nuestro grupo, sugieren que los dos sistemas FAS deben estar estrictamente co-regulados a nivel transcripcional para mantener la homeostasis lipídica en las micobacterias, y que la disrupción o alteración de dicha comunicación conduce a un microorganismo altamente comprometido en su viabilidad y/o capacidad infectiva.

Fil:Kleiman de Pisarev, Diana L.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Bley, Miguel Andrés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La glucógeno sintetasa de levadura es activada por el glucosa-6-fosfato, activación que depende del pH. Se ha encontrado que sustancias aniónicas, como el cloruro, nitrato, maleato, etc., inhiben la actividad en ausencia del éster fosfórico, pero la adición del mismo restituye la actividad al valor original. Otros aniones como el succinato, lactato y fluoruro son inhibitorios, descartándose un efecto de fuerza iónica. Usando cloruro como inhibidor modelo, se determinó que la inhibición es mixta respecto del UDP-glucosa. Los gráficos de actividad en función de la concentración de UDP-glucosa son hiperbólicos, tanto en ausencia como en presencia de cloruro o de glucosa-6-fosfato. En cambio, cuando se estudia la actividad en función de la concentración de glucosa-6-fosfato, manteniendo constante el nivel de cloruro, se obtiene curvas sigmoides. El sistema se comporta en forma similar cuando se varía la concentración de cloruro en presencia de glucosa-6-fosfato. Mediante el tratamiento de la enzima con 2,4-dinitrofluorbenceno a pH 8 en presencia de UDP-glucosa se obtiene una pérdida irreversible de la sensibilidad a la inhibición por cloruro sin pérdida apreciable de la actividad. Se concluye, por lo tanto, que los inhibidores aniónicos se unen a un sitio diferente del sustrato. Estudiando la inhibición a distintos pH se encontró que algunas sustancias tienen mayor poder inhibitorio a pH 6, que es probablemente el pH fisiológico de la levadura, que a pH 7,5. Los inhibidores más eficaces a pH 6 son el ATP, ADP y GTP. El mecanismo de acción es similar al presentado por el cloruro. La inhibición por nucleótido es revertida por el glucosa-6-fosfato. Se ha determinado que el fenómeno de reversión es especifico para el glucosa-6-fosfato y para el glucosamina-6-6fosfato. Existen otros activadores de la enzima: 2-fosfoglicérico, trehalosa-fosfato, pero carecen de la propiedad de reactivar la inhibición por las sustancias aniónicas. En base a las teorías actuales de regulación alostéricas, se discute un modelo probable de la enzima que concuerda con sus propiedades. Se ha postulado un mecanismo de control de la síntesis de glucógeno "in vivo", de acuerdo al cual la actividad de la glucógeno sintetasa se hallaría permanentemente inhibida por la presencia de ATP y ADP. Serían los niveles de glucosa-6-6fosfato (regulados por la fosfofructoquinasa en base a las concentraciones relativas de ATP y AMP) los determinantes de la velocidad de la síntesis de glucógeno. Existiría además un mecanismo adicional mediante el cual los iones amonio -regulando la activudad de la fosfofructoquinasa-canalizarían, cuando es necesario, el carbono de la glucosa hacia la formación de compuestos nitrogenados esenciales para el crecimiento.

En este trabajo de Tesis se ha identificado y caracterizado un conjunto de genes que pertenece a un circuito regulatorio involucrado en la percepción y respuesta al frío en la bacteria Gram positiva B. subtilis. Para comenzar a elucidar las bases moleculares de la percepción de la temperatura en bacterias se identificó el gen que codifica para la actividad desaturasa frío inducible de B. subtilis. El estudio de este gen, denominado des, reveló que es monocistrónico y que B. subtilis posee una única actividad desaturasa, del tipo A5 acil lípido desaturasa. Se determinó que la expresión de des se encuentra estrictamente regulada por la temperatura de crecimiento. A 37ºC su transcripción se encuentra reprimida mientras que al descender la temperatura ambiente se induce su transcripción de manera transitoria. A diferencia de la mayoría de los genes descriptos como frío-inducibles en bacterias, el gen des no es regulado a través de la estabilidad de su ARNm. La regulación del gen des por temperatura es de carácter exclusivamente transcripcional. En la búsqueda de genes involucrados en la regulación del gen des, se identificó un operón, denominado desKR, cuyo dos genes, desKR y desR, resultaron ser esenciales para la inducción por frío del gen des. Este operón codifica para proteínas con homología a las de los sistemas reguladores de dos componentes. DesR, es una proteína soluble que se une específicamente al promotor del gen des. Desk presenta homología con histidin quinasas de membrana y la evidencia experimental recogida permite postular que presenta actividades fosfatasa y quinasa sobre DesR en función de la temperatura ambiente. Finalmente, se determinó que los AGIs constituyen una señal negativa en la inducción por frío del gen des. Por lo tanto un circuito regulatorio formado por las proteínas DesK y DesR y los AGIs constituye un nuevo mecanismo de control de la expresión génica a bajas temperaturas.

Fil:Burrone, Oscar R.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La leucemia linfática crónica de células B (LLC-B) se caracteriza por la progresiva acumulación de linfocitos B clonales, que presentan muy baja tasa proliferativa y resistencia a morir por apoptosis. El objetivo de este trabajo de Tesis fue investigar el papel que cumplen los leucocitos no-malignos como posibles reguladores de la apoptosis de las células leucémicas. Por otro lado, considerando que las células LLC-B expresan receptores para el fragmento Fc de la IgG (RFCγ)y que es frecuente la presencia de complejos inmunes (Cl) en el suero de los pacientes, se analizó el papel de los RFcγ en la modulación de la sobrevida de las células leucémicas. Los resultados obtenidos demuestran que los monocitos y las células NK son capaces de prolongar la sobrevida de las células leucémicas en cultivo a través de distintos factores, tanto solubles como de contacto celular. Para tratar de identificar la producción de alguno de ellos se realizaron cultivos en presencia de anticuerpos neutralizantes anti-IFNγ,anti-IL-4 y anti-IL-10, encontrándose una marcada heterogeneidad entre los distintos pacientes evaluados. La misma variabilidad de respuesta se obtuvo al bloquear la interacción de CD40 con su ligando mediante anticuerpos anti-CD40. En conjunto, estos resultados sugieren que la capacidad de los monocitos y las células NK de favorecer la sobrevida de las células leucémicas depende de una sumatoria de señales que parecen ser particulares de cada paciente. Cuando los cultivos de células LLC-B y leucocitos accesorios se llevaron a cabo en presencia de Cl fue posible no sólo inhibir la apoptosis espontánea sino también la inducida agentes quimioterápicos como la fludarabina, el clorambucilo y la dexametasona. Es decir, que la activación de monocitos y células NK por entrecruzamiento de sus RFCγ estaría favoreciendo la acumulación del clon leucémico. Teniendo en cuenta que las células LLC-B sobre expresan la proteína antiapoptótica Bcl-2 y que la expresión de la misma se inhibe a medida que progresa la apoptosis ¡n vitro, se examinaron los niveles de Bcl-2 en las células leucémicas cultivadas con o sin leucocitos accesorios. Los resultados indican que la presencia de monocitos y células NK retarda la down-regulación de Bol-2 en las células leucémicas. Por el contrario, cuando la inhibición de la apoptosis de las células LLC-B se da a consecuencia de la activación de los leucocitos accesorios por Cl , el bol-2 no parece estar involucrado. La última parte de esta Tesis comprende el estudio de la expresión y funcionalidad de los RFcγ expresados por las leucémicas. Los datos presentados demuestran que las células B-CLL expresan no sólo el RFcγIIb característico de las linfocitos B normales, sino también la isoforma RFcγIIa. Debido a que portan dominios ITAM en su porción citoplasmática. los RFCγIIa transducen señales de activación. Sin embargo, ni la utilización de distintos tipos de Cl, ni el entrecruzamiento selectivo de los RFCγIIa logró inducir la activación de las células LLC-B, medida como cambios en los flujos de calcio. Tampoco fue posible modular la apoptosis en las Leucémicas purificadas, Lo que sugiere que este receptor no seria funcional en LLC-B.

En las distintas etapas de la expresión de los bacteriófagos la transcripción del genoma se realiza en zonas restringidas de DNA. Como consecuencia de ello, durante el ciclo lítico aparecen en forma escalonada diferentes clases de RNAs, existiendo controles positivos y negativos que regulan esta transcripción coordinada. En este trabajo se estudian los mecanismos involucrados en el control de la transcripción durante las etapas tempranas y tardías del ciclo lítico producido por el bacteriófago SP01, la influencia que ejerce la replicación sobre la transcripción viral tardía y el requerimiento de un cierto estado topológico del DNA para su replicación viral. Como introducción se realiza una revisión bibliográfica de, por una parte, el complejo de replicación y las enzimas que alteran el estado topológico del DNA, y por otra, de la maquinaria de transcripción del bacteriófago SP01, como así también los mecanismos de control conocidos. La parte experimental se divide en tres secciones: En la primera se analizan los efectos de los inhibidores de replicación sobre el ciclo lítico del bacteriófago SP01 crecido sobre distintas cepas de Bacillus subtilis. En el segundo capítulo se estudia la necesidad en el sistema de una enzima de replicación activa y cómo ésta interviene en la expresión genética. Esta función es llamada en el presente trabajo SP01 DNA topoisomerasa. En la tercera sección se estudia la incapacidad para sintetizar RNAs de clases tardías en los bacteriófagos mutantes letales condicionales de tipo supresible deficientes en replicación (DO), y se analiza además, un posible control positivo de transcripción.