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El objetivo de esta tesis fue el estudio de factores regulatorios que controlan la maduración de los ovocitos. Para investigar el papel de las células de la granulosa se caracterizó la línea celular BGC-1, obtenida por inmortalización espontánea de cultivos primarios de células de la granulosa bovinas, como modelo para el mantenimiento del arresto meiótico de ovocitos bovinos in vitro. Se determinó que las células BGC-1 inhiben el reinicio de la meiosis y la expansión del cumulus de los complejos cumulus-ovocito de manera mas eficiente que cultivos primarios de células de la granulosa, y que este efecto es específico. Se estableció que las células BGC-1 producen factor/es de naturaleza soluble y lábil, que actúan a través de las células del cumulus para inhibir el reinicio espontáneo de la meiosis in vitro. Esta inhibición es completamente reversible y, bajo el efecto inhibitorio de las células BGC-1, el reinicio de la meiosis puede ser inducido por FSH. En la segunda parte de esta tesis se estudió el rol de los catecolestrógenos, metabolitos endógenos del estradiol, durante la maduración de los ovocitos. Se pudo comprobar que la presencia de 2-metoxiestradiol durante la maduración de los ovocitos afecta el subsecuente desarrollo embrionario temprano. Se estableció que el 2-metoxiestradiol interacciona con los microtúbulos induciendo alteraciones en el huso meiótico de los ovocitos que afectan la normal segregación de los cromosomas luego de la fecundación. Los desbalances cromosómicos generados llevan a la inhibición del desarrollo embrionario en el estadio de mórula. Debido a que el 2-metoxiestradiol puede incrementarse en el fluido folicular en respuesta a ligandos del AHR, concentraciones intraováricas anormalmente altas podrían estar involucradas en los síndromes de infertilidad asociados a algunos contaminantes ambientales que son conocidos activadores de AHR.

Fil:De Robertis, E. M.F.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El principal objetivo es trazar un recorrido que permita identificar el pasaje de una consideración geopolítica del control de la natalidad hacia una idea de la planificación familiar entendida como derecho humano, antecedente clave para pensar la noción actual de derechos sexuales y reproductivos, y muchas de las dificultades que rodean su ejercicio. En esta línea, mi tesis reconstruye e interpreta discursos y experiencias claves vinculados con la regulación de la natalidad en la historia argentina reciente, desde la llegada de la píldora anticonceptiva al país y la puesta en marcha de los primeros programas de planificación familiar -sin el apoyo estatal o directamente contrariando sus disposiciones-, hasta el reconocimiento oficial de la planificación familiar como un derecho humano y la inclusión de este tema en la agenda de la democracia.

Se evaluó la capacidad de Saccobolus saccoboloides (Pezizales, Ascomycetes) de producir el sistema celulolítico completo en medio de cultivo líquido sintético. La caracterización de las enzimas producidas permite afirmar que este hongo coprófilo es un verdadero agente celulolítico, ya que su complejo enzimático presenta las tres actividades necesarias para la digestión del polímero (β-1,4 endoglucanasa, β-1,4 exoglucanasa y β-glucosidasa), y que estas enzimas son extracelulares, termoestables y (a diferencia de las de otros organismos) poco inhibidas por producto final. El crecimiento fue alto en glucosa y celobiosa, sin producción de enzimas, en tanto que en celulosa hubo muy buen crecimiento y actividad enzimática, evidenciándose diferencias de respuesta según el medio elegido. La nutrición nitrogenada no afecta la producción enzimática, sino el crecimiento: se investiga, por lo tanto, el control por fuente carbonada, en cultivos de reemplazo. En la inducción, cuando no pudo medirse endoglucanasa, se utilizó un método alternativo de degradación de CMC (Carboximetilcelulosa) en placa (CMCasa). La celulosa fue el mejor inductor, seguida por la lactosa. El sistema no se induce en presencia de glucosa, sorbosa, maltosa ni almidón, y se detecta una mínima actividad en xilano. La CMC es un pobre inductor, en tanto que la celobiosa tiene un efecto diferencial. Cuando se ensayó el efecto represor de los no inductores se ve que el sistema no se reprime fácilmente y que la glucosa y celobiosa tienen efecto diferencial. Finalmente la mezcla de dos inductores tiene un esperado efecto negativo. Las enzimas se producen en todos casos por síntesis de novo, las dos formas diferentes de β-glucosidasa se regulan independientemente, y existe inducción cruzada con el complejo xilanasa. Estos datos, junto al análisis de isoenzimas producidas en cada condición permite postular un novedoso modelo regulatorio que explicaría como los hongos filamentosos son estimulados a producir las hidrolasas específicas para degradar celulosa.

El estroma uterino experimenta cambios morfológicos y funcionales que dan lugar a la decidua, un tejido compacto cuya función es el correcto progreso de la preñez. El receptor de progesterona (RP) y el receptor de estradiol (RE) participan en el crecimiento y la diferenciación de las distintas áreas deciduales del endometrio de la rata. En esta tesis se estudia el papel de estos receptores, sus vías de señalización y la participación de nuevas moléculas involucradas en las etapas iniciales de la decidualización. Caracterizamos, mediante el uso de ARN pequeño de interferencia específico, el papel de una nueva proteína regulada en la decidualización, la proteína de unión a ARN CSD-C2. Encontramos que el bloqueo del RP, mediante su antagonista onapristona, produjo la reabsorción de los sitios de implantación (SIs) y la disminución en la expresión proteica del RP, RE, PCNA, DESMINA y CCND3, en los niveles de ARNm de Prl8a2, y de Hand2 y Bmp2, y en la activación de ERK. El efecto deletéreo de onapristona fue parcialmente contrarrestado por el antagonista del RE faslodex, restituyendo los niveles de los receptores de hormonas, de los marcadores de proliferación y diferenciación analizados, y aumentando compensatoriamente los niveles de Hand2 y Bmp2, y pERK. El tratamiento de ratas preñadas con el inhibidor de pERK, evidenció su importancia en la formación de la decidua, manteniendo la capacidad proliferativa de las células estromales y limitando su diferenciación en las distintas áreas deciduales. Estos hallazgos muestran la importancia del balance de señalización de los receptores hormonales, a la vez que describen nuevas moléculas responsables de la decidualización endometrial durante la preñez temprana.

La proteína quinasa Akt está involucrada en una gran variedad de procesos celulares tales como supervivencia, crecimiento, proliferación, migración, angiogénesis, metabolismo, resistencia a estrés, entre otros. Durante el desarrollo de esta tesis doctoral descubrimos una nueva modificación post-traduccional para esta quinasa, la conjugación a SUMO. Realizando mutaciones puntuales pudimos mapear los sitios blanco de SUMOilation en esta proteína, los aminoácidos lisina 276 y 301. Una proteína doble mutante en K276R y K301R (2KR) mostró niveles disminuídos de SUMOilación. De modo interesante, la sobre-expresión de Akt1 2KR no aumenta, y hasta inhibe, los niveles de fosforilación de un patrón global de sustratos de Akt. En este sentido demostramos que la conjugación de SUMO a Akt es necesaria para la mayoría de los procesos estudiados en los que esta quinasa participa, tales como activación del factor de transcripción NFkB, regulación del splicing alternativo, progresión del ciclo celular y supervivencia celular. Sin embargo, la función inhibitoria de Akt sobre el factor de transcripción FOXO1 no depende de su SUMOilación. Por otro lado, alteraciones en los niveles de fosforilación de Akt1 no afectan los niveles de SUMOilación de esta quinasa, y viceversa. Por último observamos altos niveles de SUMOilación en una variante hiperactiva de esta quinasa (Akt E17K) encontrada en diferentes tumores humanos. Esta hiperactividad de Akt E17K se ve afectada por la disminución en sus niveles de SUMOilación. Estos resultados son muy alentadores y permitirán en el futuro intentar determinar la relación de la conjugación de SUMO a Akt con la participación de esta proteína en el desarrollo y progresión tumoral.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016

Fil:Pecci, Adali. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El Toxoplasma gondii, es un parásito protozoario que infecta al hospedador mediante la ingestión oral de quistes tisulares u ooquistes induciendo una respuesta inmune en el intestino y sistémica del tipo Thl, produciendo inmunidad contra una re-infección. La infección experimental oral de diferentes cepas de ratones resulta en dos modelos interesantes de regulación de la respuesta inmune. Los ratones C57BL/6 (H-2b) desarrollan una ileitis inflamatoria aguda (IBD), caracterizada por la sobreproducción de IFN-γ y la síntesis de óxido nítrico en el intestino delgado dentro de los primeros siete días que, dependiendo de la dosis parasitaria inicial, puede producir la muerte debido al proceso inflamatorio. En cambio los ratones C3H/HeJ y CBA/J (H-2k) muestran solo pequeños procesos inflamatorios, cursando una infección aguda normal con establecimiento de la infección crónica. En el presente estudio, se demuestra que los linfocitos intraepiteliales (IELs) primados con antígeno de T. gondii previenen la ileitis aguda en ratones susceptibles (C57BL/6), e in virro reducen la producción de quemoquinas inflamatorias por enterocitos infectados, evento que estaría mediado por el TGF-β que secretan. Los IELs serían un componente esencial en la homeostasis del intestino luego de la infección oral con este parásito. Como un primer acercamiento en el conocimiento de la respuesta que este parásito genera en ratones que cursan una infección aguda normal, se caracterizó la respuesta de la línea celular enterocítica MODE-K (H-2k)frente a la infección para estudiar su valor como modelo in vitro. Estas células mostraron activarse frente a la infección con taquizoitos del T. gondii, secretando un patrón de citoquinas y quemoquinas cuya cinética resulta cepa específica. Los IELs derivados de los ratones CBA/J mostraron reducir la expresión de quemoquinas en los enterocitos infectados, y este efecto fue observado tanto en IELs no primados como primados. Estos IELs de ratones naïve, a diferencia de los provenientes de ratones susceptibles, producirían citoquinas anti-inflamatorias en forma endógena lo cual podría ser un componente importante en la resistencia al desarrollo de la ileitis aguda frente a la infección. La segunda parte de esta tesis estuvo enfocada al estudio de la habilidad de antígenos específicos del parásito de estimular in vitro una respuesta a nivel sistémico y de mucosas luego de una infección oral de ratones susceptibles (C57BL/6) y resistentes (BALB/c [H-2d) con el fin de evaluar su posible uso en el desarrollo de vacunas. Para esto se usaron formas recombinantes de los antígenos ROP2, GRA4 y TgPI. Los antígenos rROP2 y rGRA4 mostraron inducir una respuesta humoral, e in vitro estimularon una respuesta celular en células de nódulos mesentéricos linfáticos y de bazo del tipo Thl, que resultaron variables según la cepa de ratón que fue infectada. En cambio el antígeno rTgPI genera una baja respuesta inmune durante la infección. Notablemente, la cepa de ratones C57BL/6 produjo altos niveles de IFN-γ y una baja producción de IL-5, mientras que en BALB/c la producción de ambas citoquinas fue menor o nula respectivamente. Estos antígenos fueron utilizados en ensayos de inmunización de ratones de las cepas C57BL/6 y C3H con el fin de estudiar su valor inmunoprotectivo frente a la infección oral cuando se los combina con hidróxido de aluminio como adyuvante. rGRA4 indujo una protección parcial en ambas cepas de ratones, generando una respuesta predominante del tipo Thl mientras que rROP2 confirió protección sólo en la cepa C3H, siendo ésta más importante que rGra4. La inmunización con una mezcla de rROP2 y rGRA4, como con una proteína quimérica rROP2-rGRA4, indujo una protección parcial similar a la obtenida con el antígeno rGRA4 solo (C57BL/6) o rROP2 solo (C3H). Finalmente, el valor inmunoprotectivo de rGRA4 combinado con aluminio fue comparado con el producido por un sistema de vacunas de ADN, obteniéndose valores similares de protección parcial. En otro estudio, rTgPI mostró inducir una inmunidad protectora en ratones C3H tanto a nivel de formación de quistes como ante infecciones letales, sugiriendo una inducción de inmunidad durante la etapa aguda de la infección. Estos resultados sugieren que estos antígenos podrían considerarse buenos candidatos para el desarrollo de una vacuna multi-antigénica basada en aluminio.

Fil:De Titto, Ernesto Horacio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.