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La luz es uno de los factores más importantes en el desarrollo de las plantas. Las mismas poseen sistemas que les permiten percibir la calidad, intensidad, dirección y duración de la luz. Existen fotorreceptores específicos que registran la señal lumínica, la cual es traducida produciendo cambios en la expresión de los genes. Los fitocromos pertenecen al grupo de fotorreceptores que absorben predominantemente longitudes de onda del rojo (R) y rojo lejano (RL). El promotor del gen Lhcb es regulado por la luz a través del sistema de los fitocromos, ya que responde a muy bajas fluencias (VLFR) y altas irradiancias (HIR) de luz mediante el fitocromo A, y a bajas fluencias (LFR) de luz mediante el fitocromo B. El análisis del promotor Lhcb reveló un motivo necesario para la respuesta HIR pero no para la respuesta VLFR. Este motivo es a su vez necesario para la unión de la proteína BEL-LIKE HOMEODOMAIN 1 (BLH1) al promotor, lo cual se pudo observar tanto en experimentos in vitro como en experimentos de simple híbrido en levaduras. Sustituciones de promotor que aumentaron la unión de BLH1 también aumentaron la respuesta HIR. En contraparte, plantas mutantes blh1 mostraron una disminución en la respuesta al RL continuo pero mantuvieron valores normales a los pulsos de RL. Esto indica que el factor de transcripción BLH1 regula específicamente el HIR y no la VLFR del fitocromo A. De este modo se pone de manifiesto un mecanismo central de control de la sensibilidad a la luz por las plantas. Entre las diversas proteínas de la familia BLH se encuentran las proteínas BLH6 y BLH5, las cual es se caracterizan por presentar una alta homología estructural con la proteína BLH1. Se estudió la expresión de BLH1 y BLH6 en plantas deficientes en blh1 y blh6 y dobles mutantes blh1 blh6. Por la medida de expresión del gen β-glucuronidasa se pudo determinar que existe una regulación mutua entre las proteínas BLH1 y BLH6. Estudios fisiológicos sobre múltiples mutantes blh1, blh5 y blh6, indicaron una función aditiva de miembros de la familia BLH.

Conocida inicialmente como la “hormona de la gordura” por su asociación con la saciedad y el balance energético del organismo, la leptina, una proteína de 16 kDa, también es reconocida actualmente por el papel fundamental que posee en la biología reproductiva. La expresión de la leptina y de sus receptores, descubierta originalmente en tejido adiposo, se ha evidenciado en otros tejidos tales como placenta, en donde la síntesis de leptina es altamente regulada. Los niveles de leptina aumentan tempranamente durante la gestación, aún antes de que se incremente el tejido adiposo, sugiriendo que existen otros factores que modulan su producción. Sin embargo, los mecanismos de acción de la leptina sobre la implantación y el crecimiento embrionario son aún desconocidos. El presente trabajo ha sido desarrollado con el objeto de estudiar las vías de transducción de señales activadas por leptina en placenta y para elucidar los mecanismos que median el efecto antiapoptótico de leptina. Más aún, dado que la leptina sería importante en la supervivencia celular y en el mantenimiento de la placenta, analizamos la regulación de la expresión de leptina en placenta por la hormona gonadotrofina coriónica y por AMPc. Se utilizaron como modelo las líneas celulares trofoblásticas JEG-3 y BeWo, y explantos de placenta humana a término. Demostramos que la unión de la leptina a su receptor causa la estimulación de las vías de señalización de JAK/STAT, MAPK, p38MAPK y PI3K. Asimismo, hallamos que la leptina cumple una función antiapoptótica en células trofoblásticas y que ejerce dicha función principalmente a través de la vía de MAPK. Cuando estudiamos la regulación de la expresión de leptina, los resultados mostraron que la hCG, una hormona esencial del embarazo, estimula la transcripción y la síntesis de leptina en placenta. Contrario a lo esperado, el AMPc inhibió la inducción de leptina por hCG. El efecto de hCG sobre leptina parece estar mediado por la vía de MAPK. Observamos que el AMPc estimula la expresión de leptina en placenta y que el nucleótido es capaz de activar no sólo la vía de señalización de PKA sino también la de MAPK. En este sentido, demostramos que la acción inductora del AMPc sobre leptina estaría mediada por un entrecruzamiento entre dichas vías. En síntesis, los resultados obtenidos contribuyen a esclarecer el modo de acción de la leptina en placenta así como los mecanismos de regulación de la expresión de la proteína, y sustentan la importancia de la leptina en la biología de la reproducción.

Leptina, proteína de 16 kDa sintetizada y secretada principalmente por el tejido adiposo, parece ser un regulador de la función reproductiva. En este trabajo evaluamos la acción de distintos niveles de leptina sobre la expresión de las principales isoformas de su receptor en el eje hipotálamo-hipófisis- ovario, y el efecto de NPY y 17β-estradiol sobre estos receptores en el eje hipotálamo-adenohipófisis, ambos durante el proceso ovulatorio. Utilizamos como modelo biológico ratas inmaduras estimuladas con gonadotrofinas y evaluamos mediante estudios in vivo e in vitro la expresión del mensajero (RTPCR) y de la proteína (western blot) de los receptores de leptina. Encontramos que tanto leptina como las gonadotrofinas son capaces de regular diferencialmente la expresión del mensajero y de la proteína de ambos tipos de isoformas en el eje reproductivo, en forma dosis y tejido dependiente. Por otro lado, NPY y 17β-estradiol fueron capaces de inducir la expresión del mensajero y de la proteína de ambas isoformas en el eje hipotálamo-adenohipófisis a través del receptor de NPY tipo 1 y de los receptores estrogénicos α y/o β, respectivamente. Como el efecto estimulatorio o inhibitorio de leptina sobre la función ovárica podría depender de la activación diferencial de sus receptores, estudiamos las vías JAK2/STAT3 y ERK1/2, y la expresión de SOCS3 (western blot) en el eje reproductivo durante el proceso ovulatorio. Utilizamos ratas estimuladas con gonadotrofinas las que recibieron los siguientes tratamientos: i) tratamiento agudo, las que recibieron 5 dosis de leptina (5 μg c/u) o vehículo durante el proceso ovulatorio, o ii) tratamiento diario, las que recibieron 3 μg de leptina o vehículo por día durante 12 días a partir del destete. Observamos que el tratamiento agudo, que inhibe la función ovárica, i) disminuye la expresión de p-ERK1/2 en hipotálamo, adenohipófisis y ovario; ii) disminuye la expresión de p-STAT3 en adenohipófisis y ovario; y iii) aumenta la expresión de SOCS3 en adenohipófisis y ovario. En el tratamiento diario, que estimula la función ovárica, observamos que i) aumenta la expresión de p-STAT3 y p-ERK1/2 en hipotálamo y en ovario; ii) disminuye la expresión de SOCS3 en ovario; y iii) no hubo cambios en estas vías en adenohipófisis. Al evaluar in vitro la acción directa de leptina sobre estos caminos de señalización en ovario observamos que la presencia de leptina es capaz de aumentar la expresión de p-STAT3 a bajas y altas concentraciones, la expresión de p-ERK1/2 a bajas concentraciones y los niveles de SOCS3 a altas concentraciones. Con estos resultados podemos concluir que las gonadotrofinas, leptina, NPY y 17β-estradiol son capaces de regular la sensibilidad a leptina a lo largo del eje reproductivo por modular la expresión de sus receptores, y que los cambios observados en las distintas vías de señalización inducidos por diferentes niveles de leptina pueden ser, al menos en parte, responsables del efecto positivo o negativo que leptina ejerce sobre el proceso ovulatorio. Palabras claves: receptor de leptina, leptina, NPY, 17β-estradiol, hipotálamo, adenohipófisis, ovario, proceso ovulatorio, JAK2/STAT3, ERK1/2, SOCS3.

Fil:Radrizzani Helguera, Martín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Bernath, Viviana A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La levadura Saccharomyces cerevisiae es capaz de incorporar y metabolizar el ácido γ-aminobutírico (GABA) gracias a los productos de tres genes: UGA4, UGA1 y UGA2. El primero de ellos, UGA4, codifica para una permeasa específica de GABA que es capaz de incorporar este aminoácido a las células. Luego, el GABA puede ser degradado por las enzimas GABA transaminasa y succinato semialdehído deshidrogenasa, codificadas por los genes UGA1 y UGA2, respectivamente. Estos genes son inducibles por GABA y esta inducción depende de los factores de transcripción Uga3 y Uga35/Dal81. Estudios previos reportaron que la inducción del gen UGA4 se ve afectada por la presencia de aminoácidos en una forma dependiente del sensor SPS. En este trabajo demostramos no sólo que el sensor SPS interviene en la regulación por leucina del gen UGA4, sino que también los factores Stp1 y Stp2 intervienen en esta regulación. En presencia de leucina, se observó un menor reclutamiento de los factores Uga3 y Uga35/Dal81 al promotor UGA4, lo que sería la causa de la menor inducción observada en esas condiciones. Por otra parte, se demostró que esta alteración en la interacción de dichos factores con el promotor UGA4 es causada por una señal disparada por el sensor SPS. Ambos factores, Uga3 y Uga35/Dal81, actúan a través del elemento UASGABA presente en el promotor UGA4 y dependen uno del otro para poder interactuar con dicho elemento. Más aún, nuestros resultados sugieren que el factor de transcripción Uga35/Dal81 interactúa con el promotor UGA4 a través del factor Uga3. Por otra parte, se demostró que la inducción de la expresión de los otros genes miembros del regulón UGA, UGA1 y UGA2, es también inhibida por aminoácidos en una forma dependiente del sensor SPS y que esta regulación ocurre muy probablemente a través del mecanismo establecido para UGA4. Por último, demostramos que el factor de transcripción Leu3 regula negativamente la expresión de los genes UGA4 y UGA1 pero no interviene en la regulación de UGA2.

La germinación de las semillas es un proceso expansivo, definido por el ingreso de agua a los ejes embrionales y es visualizado como la protrusión radicular a través de las envolturas seminales. Los mecanismos fisiológicos y moleculares que controlan la germinación de las semillas de soja (Glycne max (L.) Merr.), y especialmente el rol del Ácido Abscísico (ABA) sobre dicho proceso, constituyen el núcleo principal del presente trabajo. Los ejes inmaduros, entre 25 y 40 días después de antesis (DDA), poseen elevadas concentraciones de ABA ([ABA]e), las cuales descienden a valores no inhibitorios hacia la madurez. Presentan en consecuencia, restricciones para germinar, con tasas de germinación in vitro crecientes con la edad. Por otra parte, los ejes embrionales maduros (45 DDA, madurez fisiológica y >60 DDA, maduros y secos) no están intrínsecamente inhibidos por la [ABA]e para germinar, aunque la germinación puede ser bloqueada bajo incubación en presencia de ABA exógeno. En base a estos conocimientos, ejes embrionales de semillas de soja, cosechadas entre los 25 y >60 DDA, constituyeron un modelo experimental adecuado para establecer relaciones causa-efecto entre el ABA y el/los posible/s responsable/s metabólico/s que participa/n de la germinación y es/son controlado/s por éste. Al mismo tiempo, permitieron centrar el foco de estudio en el órgano primario implicado en la germinación, sin tener en cuenta los demás órganos seminales que no cumplen roles decisivos en este proceso. La [ABA]e se cuantificó mediante radioinmunoanálisis, utilizando el anticuerpo monoclonal DBPA1. Para los análisis moleculares se tuvieron en cuenta dos regiones del eje embrional, una de ellas consideró a ambos extremos (plúmula + radícula) y la otra, definida como "Zona de Elongación", ZE, comprendió la porción del hipocótilo, cuyas células experimentan estrictamente la expansión, constituyendo por lo tanto, la zona principal de estudio. Se evaluó la germinación de ejes embrionales en agua destilada, y en diferentes medios de incubación. La naturaleza expansiva de la germinación fue evaluada a través del control por restricción osmótica durante la imbibición en soluciones de Polietilenglicol 8000 (PEG). La incubación en buffer pH8 tuvo por objetivo inhibir el "crecimiento ácido" descripto como evento inicial responsable del alargamiento celular durante la germinación. El control por ABA sobre las paredes celulares, impidiendo que éstas se relajen, evitando la expansión y el alargamiento del eje embrional, fue evaluado a partir de incubaciones en presencia de la hormona. La estrategia de búsqueda se orientó a identificar secuencias Expansinas, cuya actividad óptima a pH~4 es indicada sobre el crecimiento ácido de paredes celulares vegetales, resultando por lo tanto responsables primarias de la remodelación de las paredes celulares en la ZE que da lugar al proceso expansivo durante la germinación. Se evaluó la presencia de Expansinas a nivel de ADN genómico. Posteriormente, se amplificó y secuenció un fragmento (EXPAI-like) a partir de ARN mensajero (ARNm) de la ZE de ejes embrionales germinados en agua destilada, el cual presentó una alta homología con la Expansina 1 de soja. Los análisis de expresión se realizaron por la técnica de Transcripción Reversa seguida de Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa, en un único paso, semicuantitativa (RT-PCR) y en dos pasos, cuantitativa y en Tiempo Real (RT-qPCR). Los resultados mostraron la presencia de EXPAI-like mayoritariamente en la ZE de los ejes embrionales, e indicaron tanto que hubo represión por ABA y pH18 como inducción en agua destilada y PEG. Adicionalmente, la presencia del transcripto aún en ejes sin incubación determinó que EXPAI-like forma parte de las biomoléculas almacenadas en el eje embrional de la semilla de soja durante su formación. Estudios complementarios mostraron que, en presencia de un inhibidor transcripcional (a-Amanitina), los ejes embrionales germinaron, aunque a menor tasa y porcentaje que en agua destilada; en tanto no germinaron cuando la traducción fue inhibida en Cicioheximida, indicando que la germinación es posible a partir de los ARNm acumulados durante el desarrollo. Por otra parte, se registró un incremento de expresión progresiva de EXPAI-like en la ZE de ejes embrionales de 25 a >60 DDA, el cual se relacionó con la [ABA]e decreciente a través del desarrollo. Similarmente, tanto el incremento de EXPAI-like como la caída de [ABA]e ocurrieron durante la incubación en condiciones de germinación para cada edad. A partir de estos resultados se postula que EXPAI-like participaría de los eventos moleculares decisivos durante la germinación en soja, permitiendo el relajamiento de paredes celulares necesario para que la misma ocurra. Por su parte, la [ABA]e operaría reprimiendo tanto la síntesis del transcripto EXPAI-like como los eventos moleculares aguas abajo del mismo.

Fil:Ochoa, Alberto Ricardo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El primer paso en la biosíntesis del hemo en las células animales es catalizado por la enzima mitocondrial δ-aminolevulinato sintetasa (ALA-S), que condensa glicina y succinil CoA para formar ácido 6-aminolevulínico y que, al menos en hígado, es la limitante de la velocidad. En hígado esta enzima constitutiva regula la producción de hemo necesario para sintetizar las proteínas citocromos P-450. Aunque en los tejidos animales el nivel de enzima es muy bajo, la transcripción del gen de ALA-S en hígado de animales de experimentación aumenta cuando se les administran compuestos porfirinogénicos como el fenobarbital. Diferentes mecanismos fueron propuestos por los que el hemo puede regular la expresión de ALA-S a nivel transcripcional reprimiendo la sintesis del RNA, a nivel postranscipcional disminuyendo la estabilidad del mensajero y a nivel postraduccional inhibiendo la entrada de la enzima a la mitocondria. En el presente trabajo examinamos el mecanismo ejercido por cAMP y glucosa sobre la expresión génica de ALA-S en hepatocitos de ratas normales y con diabetes experimental, y en cultivos de células HepG2. Se ha demostrado que el cAMP potencia la inducción mediada por fenobarbital, aumentando la cantidad del mRNA de ALA-S a través de la activación de la quinasa de proteínas dependiente de cAMP. El efecto inductor ejercido por el fenobarbital es mayor en hepatocitos diabéticos que en normales debido probablemente al nivel de cAMP elevado que presentan. Por otro lado, se ha demostrado que la glucosa inhibe la inducción de la expresión de ALA-S mediada por fenobarbital en hepatocitos normales pero no en diabéticos. Este efecto glucosa es revertido por la presencia de dibutiril CAMP,de activadores de la adenilil ciclasa o de un inhibidor de fosfodiesterasa. Se presentan evidencias que los efectos del cAMP y la glucosa son ejercidos a nivel transcripcional. La vida media del mRNA de ALA-S no se modifica en presencia de ellos. Mas aún, los efectos de cAMP y la glucosa se manifiestan en el análisis de tranfecciones transientes de células HepG2 con un vector que contenie la región promotora del gen ALA-S clonada en 5’ del gen de la cloramfenicol acetiltransferasa. En este tipo de experimentos hemos confirmado además que el efecto de cAMP requiere la activación de la proteina quinasa dependiente de cAMP ya que hemos obtenido resultados similares cotransfectando con la subunidad C de la PKA. Finalmente se demuestra que la activación de la PKC actúa negativamente sobre el mRNA de ALA-S, probablemente a nivel transcripcional, de acuerdo a las determinaciones por Northern, slot blot y análisis de transfecciones transientes de células HepG2. Asimismo se observa que el efecto del éster de forbol TPA anula el efecto inductor del cAMP. Es posible que ambos caminos de transducción de señales, que involucran la activación de PKA y PKC, estén interconectados en la regulación de la expresión génica de ALA-S.

La placenta produce un amplio número de moléculas esenciales para el establecimiento y el mantenimiento del embarazo. En este contexto, la leptina presenta un papel importante en la reproducción. La leptina es una proteína de 16 kDa codificada por el gen LEP, y fue descripta originalmente como una molécula producida por el tejido adiposo involucrada en la regulación del metabolismo a nivel central. Sin embargo, se ha sugerido que esta proteína presenta otras funciones durante la gestación, particularmente en la placenta, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. La síntesis de leptina en células trofoblásticas está modulada por diferentes agentes endógenos, pero aún no se comprende totalmente cómo se regula su expresión génica. En este trabajo, se analizó el efecto del 17β-estradiol (E2) sobre la expresión de leptina en la placenta humana utilizando dos modelos experimentales: la línea celular BeWo, derivada de coriocarcinoma, y explantos de placentas humanas a término. Se ha observado la estimulación de la expresión de leptina endógena en respuesta a E2, a través de ensayos de Western blot y qRT-PCR. Este efecto fue dosis y tiempo dependiente e involucraría a los receptores de estrógenos, ya que el antagonista ICI 182,780 inhibió la acción del E2. Además, experimentos de transfección transitoria mostraron que el tratamiento con E2 aumentó la actividad transcripcional del promotor de leptina, y la región promotora comprendida entre -1951 pb y -1847 pb sería necesaria y suficiente para observar los efectos del E2. La acción de E2 también involucraría receptores de membrana, ya que la incubación con este esteroide promovió la fosforilación de MEK, ERK 1/2 y AKT en explantos placentarios. Apoyando esta hipótesis, el análogo E-BSA, que no atraviesa la membrana plasmática, indujo la expresión de leptina en ambos modelos experimentales, y activó rápidamente las vías de señalización de las MAPKs y PI3K. Los efectos del E2 y del E-BSA fueron bloqueados por inhibidores farmacológicos de las vías MAPKs y PI3K así como también a través de la expresión de mutantes dominantes negativas de MEK, ERK 1/2 y AKT, sugiriendo que estas cascadas de señalización estarían involucradas en la regulación de la expresión de leptina. Por otro lado, se ha demostrado la presencia del receptor de estrógenos alfa (ERα) en el núcleo y en la membrana plasmática de las células BeWo. Esta proteína podría mediar los efectos genómicos y no genómicos del E2. Apoyando esta idea, la sobreexpresión de ER potenció los efectos del E2, mientras que la disminución de los niveles de ERα a través de un ARN de interferencia específico disminuyó los efectos del E2 y del E-BSA sobre la expresión de leptina. El análisis in silico del promotor de leptina mostró posibles sitios ERE y half ERE para la unión de receptores ER, además de distintas secuencias que podrían interactuar con los factores de transcripción AP-1, CREB, NFκB y Sp1. La expresión de isoformas wild type o mutantes dominantes negativas de estas proteínas mostraron una posible interacción entre ellas y los ERs, la cual podría estar implicada en la regulación de la expresión de leptina placentaria. En conclusión, este trabajo demuestra que el E2 induce la expresión de leptina en células trofoblásticas a través de acciones genómicas y no genómicas, donde participan receptores de estrógenos de membrana y nucleares, distintos factores de transcripción y diferentes vías de transducción de señales. Estos mecanismos pueden estar desregulados en distintas patologías del embarazo.