Catálogo de publicaciones

Fil:Alperín, Daniel Mario. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Finocchiaro, Liliana María Elena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El trabajo experimental presentado en esta tesis se realizó con el objetivo de investigar la influencia de la glándula pineal sobre el sistema inmune, eligiéndose como función a evaluar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA). Los experimentos se llevaron a cabo en ratones de la cepa BALB/c de ambos sexos.

El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el rol del sistema retinoide en la progresión del tumor mamario murino LM38-LP, haciendo énfasis en las interacciones celulares entre su componente luminal (LEP) y mioepitelial (MEP). Determinamos que la línea LM38-LP expresa receptores retinoides y que los mismos son funcionales. El tratamiento con retinoides induce en la línea un arresto del ciclo celular. El mismo tratamiento induce apoptosis sólo en el compartimiento LEP y senescencia en las células MEP, mientras que una pequeña población celular que mediaría la interacción entre ambos componentes continúa ciclando. Asimismo se ha podido determinar la existencia de una población con características de células stem/progenitoras parcialmente resistentes al tratamiento con retinoides. Hemos estudiado además mecanismos implicados en la diseminación metastásica de la línea LM38-LP. En este sentido hemos observado que los retinoides inhiben tanto la actividad de proteasas secretadas como la capacidad migratoria, mientras que aumentan la capacidad adhesiva a componentes de la matriz extracelular. Los retinoides inhiben la invasión sólo en la población MEP de la línea LM38-LP. Se analizó la transcripción de un panel de genes implicados en el proceso de transición epitelio-mesenquimática. Se pudo determinar que el ácido retinoico modula estos genes diferencialmente entre los compartimientos LEP y MEP conduciendo a la línea hacia un fenotipo menos agresivo. Se generaron sublíneas que presentan silenciados o sobreexpresados los distintos receptores retinoideos, lo que permitió evaluar la participación de cada uno de ellos en la progresión tumoral maligna de la línea en estudio. Este trabajo sugiere que los retinoides ejercen efectos pro-apoptóticos y citostáticos diferenciales en los diferentes compartimentos celulares de la línea LM38-LP. Asimismo los resultados sugieren la existencia de una tercera población con capacidad clonogénica y resistente a los retinoides.

Fil:Bozzini, Carlos E.J.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Este trabajo pretende dilucidar algunos de los mecanismos regulatorios de la esteroidogénesís adrenal por Endotelina (ET) y Adrenocorticotrofina (ACTH) y el rol de la 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11β-HSD). Con este fin se obtuvieron los siguientes aportes: Adrenales de ratas infundidas con ET presentan, además del efecto corticoidogénico ya conocido, a) un incremento de la captación del sustrato primario para la esteroidogénesís, colesterol, in vitro; este incremento es mediado por los receptores ETB. b) un incremento en la actividad del citocromo P-4505scc, mediado por los receptores ETA. La actividad de la 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa no se modifica por ET. La glándula adrenal de rata y vaca expresa actividad de las isoformas l y 2 de la 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11β-HSD). Ambas isoformas presentan características bioquímicas y cinéticas similares a las halladas en otros órganos de rata y en otras especies. En ratas, el tratamiento agudo con ACTH in vivo produce una disminución de la actividad adrenal de esta enzima, mientras que el tratamiento crónico (48 hs) causa un aumento de la misma. Este último incremento es mediado por un aumento en los niveles proteicos de la 11β-HSD-2 aunque no se modifican los niveles de su mRNA. Se propone un modelo de regulación de la esteroidogénesís adrenal por la actividad de la 11β-HSD. El tratamiento agudo con ACTH de células dispersas de fasciculata adrenal de rata produce una disminución de la actividad de 11β-HSD determinada en células enteras o en sus microsomas. Esta regulación sería mediada por la vía de cAMP-PKA ya que es revertida por inhibidores de esta kinasa y simulada por db-cAMP. Además, la presencia de fosforilaciones/desfosforilaciones se comprueba con experimentos con fosfatasa alcalina. Se realizó el clonado, expresión y caracterización de la 11β-HSD-2 bovina. Se estudiaron las características bioquímicas y cinéticas de la proteína expresada en células CHOP. La comparación estructural, cinética y funcional de la 11β-HSD-2 bovina demuestra estrecha similitud con su contraparte de rata y humana.

En los anfibios estudiados, tanto la esteroidogénesis como la espermiación pueden ser estimuladas por las distintas gonadotrofinas: la hormona luteinizante (LH), la gonadotrofina coriónica humana (hCG) y la hormona folículoestimulante (FSH). En Rhinella arenarum, la acción de hCG sobre la espermiación no requiere de la biosíntesis de esteroides aunque para la regulación de ambos procesos se requeriría la activación de la proteína quinasa A (PKA). Uno de los objetivos de esta tesis fue estudiar la participación de la PKA y de la proteína quinasa C (PKC) en la acción de las gonadotrofinas sobre la proteína StAR (Steroidogenic Acute Regulator protein), considerada en mamíferos el paso limitante y hormonalmente regulable de la esteroidogénesis, y sobre el proceso de espermiación. Para el estudio de la regulación de la esteroidogénesis, primero se llevó a cabo la caracterización molecular del ADN copia (ADNc) de StAR. Los resultados obtenidos mostraron no solo un alto porcentaje de similitud de la secuencia de StAR con la proteína de otros vertebrados sino también la conservación de los sitios consenso para la fosforilación por PKA descriptos en mamíferos. Esto último resultó consistente con el aumento de la expresión del ARN mensajero ante los estímulos de hCG o de activadores de PKA, aumentos que no se observaron en la expresión de la proteína. Además, dado que en esta especie los glucocorticoides disminuyen la síntesis de andrógenos, procedimos al análisis del efecto de los mismos sobre la proteína StAR y sobre la producción de esteroides. No se observaron variaciones en la expresión basal de la proteína ni en la estimulada por hCG, luego del tratamiento con distintas dosis de corticosterona o dexametasona. Esto permite inferir que la disminución de la síntesis de andrógenos por efecto de los glucocorticoides no está relacionada con la proteína StAR. Para el estudio de la espermiación, proceso dependiente de gonadotrofinas, se analizaron tanto la función no canónica de la bomba Na+/K+ como la activación de las vías de PKA y PKC. los resultados obtenidos refuerzan la propuesta de la participación de la forma no canónica de la bomba Na+/K+ y del rol de PKA en el proceso de espermiación pero no de PKC. Por otra parte, sólo la activación de PKA afectó significativamente la producción de testosterona, confirmando que la esteroidogénesis y la espermiación se regulan por distintos mecanismos.

La concentración de proteínas en el grano de trigo es uno de los determinantes de la calidad panadera y por lo tanto del precio del grano. Como los aminoácidos que las conforman provienen de los órganos vegetativos desde donde son transportados por el floema, el estudio de los factores que regulan la exportación de aminoácidos al floema es relevante para la comprensión de la acumulación de proteínas en el grano. En el presente trabajo se estudiaron las causas fisiológicas de la disminución en la concentración de proteínas en el grano debido a la ausencia del brazo corto del cromosoma 7B de trigo (Triricum aestivum L.) en la línea ditelosómica CSDT7BL de la variedad Chinese Spring. Se evaluó el transporte de aminoácidos desde los órganos fuente hacia el grano, que mostró estar disminuido a altas disponibilidades de N, con respecto a las plantas euploides. Por lo tanto se emprendió el estudio de la regulación de la exportación de aminoácidos al floema en plantas jóvenes de otras variedades cultivadas en condiciones controladas mediante la técnica de exudación facilitada con EDTA. Las plantas fijeron sometidas a diferentes regímenes de nitrógeno, lumínicos, o al agregado exógeno de citocininas. Se concluyó que en condiciones estables de crecimiento los aminoácidos exportados al floema provendrían del nitrógeno recientemente reducido, mientras que en situaciones de estrés, serían los aminoácidos almacenados previamente en las hojas o los derivados de la proteólisis los que se exportan. Por otro lado, esta exportación resultó ser independiente de la exportación de azúcares al floema, tanto como de la disponibilidad de fotoasimilados en las hojas, en cambio las citocininas mostraron un efecto promotor dependiente de la disponibilidad de nitrógeno. Luego, se emprendieron ensayos con las plantas CSDT7BL en cámara de cultivo exponiendolas a las condiciones determinadas en la primera parte, capaces de generar cambios en la exportación de aminoácidos. El conjunto de los resultados obtenidos sugiere que esta línea posee una deficiencia para la exportación de aminoácidos al floema que se manifiesta en altas disponibilidades de nitrógeno, alcanzando una meseta a una concentración externa de nitrógeno menor que en las euploides, que no pareciera depender de la forma en que éste se suministre. Esta deficiencia podria ser la causante de la disminución en la concentración de proteínas en el grano maduro, ya que se encontró una correlación positiva entre estos parámetros en las plantas cultivadas en el campo.

El género Mycobacterium está compuesto por organismos aerobios, no esporulados, con elevado contenido de G+C en sus genomas y con una estructura de pared celular muy particular y rica en lípidos, constituyendo estos componenetes más del 60% del peso seco de la bacteria. La envoltura celular de las micobacterias es una estructura compleja compuesta por la membrana plasmática y la membrana externa. La membrana plasmática no difiere de la membrana de otras bacterias, mientras que la membrana externa es una macromolécula químicamente compuesta por tres constituyentes unidos covalentemente: pétidoglicano, arabinogalactano y ácidos micólicos. Los lípidos son constituyentes fundamentales de todas las células por ser componentes estructurales de las membranas. La biosíntesis de ácidos grasos es el primer paso en la formación de los lípidos de membrana y es esencial para las bacterias. Estos componentes son sintetizados mediante sintetasas de ácidos grasos (FAS) que pueden ser de dos tipos FASI y FASII. La composición lipídica de las membranas biológicas varía según las condiciones ambientales, por ejemplo ante cambios de temperatura. Una disminución en la misma produce un aumento en la rigidez de las membranas que requiere la presencia de AGI para recuperar la fluidez necesaria de aquellas. Sin embargo FAS solamente pueden sintetizar AGS. La síntesis de AGI en bacterias se lleva a cabo mediante dos mecanismos: uno anaeróbico y uno dependiente de oxígeno, catalizado por enzimas denominadas desaturasas. Las desaturasas reclutan y activan el oxígeno molecular para modificar enlaces carbono-hidrógeno en una cadena acilada, dando como producto un AGI. Por ello, en este trabajo, se decidió analizar el efecto de los cambios de temperatura sobre la fisiología de M. smegmatis. Para ello se llevaron a cabo diferentes tipos de análisis. Se realizaron curvas de crecimiento a diferentes temperaturas y se analizó además la composición lipídica (a través de TLC y GC-MS) en estas condiciones, tanto de ácidos grasos de cadena corta-media, como de ácidos micólicos. Además, se realizó un análisis transcripcional de las regiones promotoras de las desaturasas y sus óxido-reductasas a diferentes temperaturas y en presencia de ácidos grasos insaturados. Se determinó que una disminución en la temperatura produce una reducción en la velocidad de crecimiento, un aumento en la síntesis de AGI y un aumento en la proporción de ácidos  y  micólicos, en tanto que una reducción en la cantidad de ácidos ‟ micólicos. La actividad transcripcional de las desaturasas no se vio afectada por el descenso en la temperatura, pero se redujo en presencia de AGI. El genoma de M. smegmatis codifica para cuatro enzimas con homología a la estearoil-desaturasa DesA3 de M. tuberculosis. Para determinar la función de estas enzimas se utilizaron diferentes estrategias. Por un lado se delecionó el gen MSMEG_1886 mediante recombineering y se caracterizó fenotípicamente a la mutante UNR1886. Se determinó que esta cepa presenta un defecto severo tanto en el crecimiento en medio líquido y sólido, como en la síntesis de AGI, principalmente C16:1 y C18:1. Para determinar la función del resto de las desaturasas se realizaron ensayos de complementación de la cepa UNR1886 con cada desaturasa, bajo un promotor inducible por acetamida. Sin embargo, mediante esta metodología no se obtuvieron resultados satisfactorios. Por ello se silenciaron las desaturasas mediante ARNm antisentido, tanto en la cepa salvaje mc2155 como en la cepa UNR1886. Se analizó el crecimiento en medio líquido y la composición lipídica mediante GC-MS. Las cepas que expresan los ARNm antisentido presentaron una disminución en la velocidad de crecimiento y una alteración en los perfiles de lípidos. Se determinó que los genes MSMEG_1211 y MSMEG_1743 podrían ser desaturasas de ácidos grasos, mientras que no se encontró evidencia suficiente para asignar una función a MSMEG_6835. Es necesario entonces, delecionar estos tres genes para definir la función exacta de cada uno de ellos. Además se evaluó el efecto de la droga antituberculosa isoxil sobre el crecimiento de las cepas mc2155 y UNR1886, determinándose que la CIM para esta dorga disminuye cuatro veces en la cepa mutante respecto de la cepa salvaje. El efecto sobre el crecimiento en la cepa mutante revierte por el agregado de AGI al medio. Por ello, se postula a MSMEG_1886 como uno de los blancos posibles de isoxil en M. smegmatis.

A lo largo de los últimos años, se ha acumulado una vasta evidencia experimental señalando a NF-κB como uno de los factores de transcripción (FT) más relevantes en la formación y reprocesamiento de memorias de largo término (MLT) en distintos modelos animales y tareas de aprendizaje. Sin embargo, poco se sabe de los genes que son regulados por este FT durante procesos mnésicos. El objetivo de mi tesis fue identificar y caracterizar algunos de los genes que son regulados por este FT durante la consolidación de la memoria de reconocimiento de objetos en el hipocampo de ratón. Los resultados obtenidos indican que durante este proceso, NF-κB regula la expresión de genes de respuesta temprana y tardía, en particular, del FT ZIF268 y de la proteinquinasa Ca(2+)-Calmodulina-quinasa II δ (CaMKIIδ), una sub-unidad de CaMKII cuya función en el sistema nervioso central se desconoce. El entrenamiento al paradigma de Reconocimiento de Objetos Novedosos, que lleva a la formación de una memoria de reconocimiento de largo término, indujo la expresión de ambos genes. ZIF268 se expresa de manera rápida y transitoria dentro de las primeras horas postentrenamiento y su expresión es necesaria para la formación de una MLT. Por el contrario, la expresión de CaMKIIδ se induce en forma tardía y sostenida, y persiste hasta por lo menos 7 días luego del entrenamiento. Sorprendentemente, nuestros resultados indican que CaMKIIδ no afecta la formación de la MLT, sino la formación y mantenimiento de una forma de MLT más persistente. A continuación, mostramos que la ocupación nucleosomal en ciertas regiones claves del promotor de CaMKIIδ se ve afectada hasta 7 días luego del entrenamiento. Esta es la primera vez que se demuestra que este tipo de modificaciones epigenéticas tienen lugar durante la formación y mantenimiento de la MLT. Por último, hallamos que, en neuronas piramidales del hipocampo, CaMKIIδ se localiza principalmente en el núcleo, dendritas y terminales pre-sinapticas. Nuestros estudios funcionales, junto con los de localización sub-celular aportan los primeros indicios respecto a los mecanismos moleculares en los que podría intervenir CaMKIIδ en el sistema nervioso central.