Las cianobacterias, las algas y las plantas superiores son capaces de captar la energía lumínica para la reducción fotosintética de C02 a (CH20) utilizando H20 como reductor. Este proceso se lleva a cabo en el caso de las plantas superiores en organelas especializadas, los cloroplastos, los cuales contienen los pigmentos que absorben la luz distribuidos en vesículas membranosas (tilacoides). Una vez captada, la energía lumínica es covertida en energía electroquímica en la cadena fotosintética de transporte de eletrones. En este proceso se generan ATP y NADPH, los cuales son utilizados por las enzimas del ciclo de Benson-Calvin (ciclo reductivo de las pentosas fosfato), localizadas en la porción soluble del cloroplasto (estroma), para la fijación del C02. Estas enzimas, a excepción de la fosforribuloquinasa y la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (la proteína más abundante en la naturaleza) están distribuídas ampliamente entre los organismos vivos y actúan tanto en la síntesis como en la degradación de los hidratos de carbono en animales, plantas y microorganismos. En el caso de los organismos fotosintéticos, dichas enzimas están involucradas en la asimilación, acumulación y degradación de los compuestos carbonados. A diferencia de las enzimas de organismos heterotróficos, las enzimas del estroma de cloroplasto (y cianobacterias) presentan la particularidad de ser reguladas por la luz: las que intervienen en la asimilación del C02 son activas en la luz e inactivas en la oscuridad, en tanto una situación opuesta se observa con las enzimas que intervienen en la degradación de los hidratos de carbono. Los estudios in vitro han tratado de correlacionar la activación enzimática mediada por efectores con los cambios en sus concentraciones, que ocurren en el estroma del cloroplasto al producirse la transición oscuridad-luz. [ver Tesis] En esta tesis, utiiizando extractos de plantas superiores, en particular de espinaca, se estudió la participación conjunta de los diferentes mecanismos modulados por luz en la regulación de las enzimas claves del ciclo de Benson-Calvin. Este ciclo inactivo en oscuridad alcanza su máxima actividad luego de varios minutos en luz. Esta fase de inducción ha sido interpretada por la acumulación gradual de metabolitos generados fotoquímicamente, así como también la conversión lenta de un estado inactivo a uno activo durante la transición oscuridad-luz. Este tipo de cinética enzimática fue descripta por Frieden y se denominó a dichas enzimas "histeréticas". De acuerdo con esta característica es que los ensayos de las reacciones enzimáticas se llevan a cabo en dos etapas: a) Fase de modificación lenta (min), en la que la enzima se preincuba con el sistema modulador correspondiente y b) Fase catalítica rápida ( « segundo), que convierte en la medición de la actividad catalítica. Los resultados obtenidos señalan que: 1) La activación completa de la FBPasa purificada a homogeneidad se produce por la acción de un metal bivalente, en particular el Ca2+ y su sustrato, la FBP, a pH y (Mg2+) presentes en el cloroplasto iluminado. En el proceso de activación, la tiorredoxina-f reducida químicamente con DTT regula la concentración de la FBP como efector, mientras que su concentración como sustrato es modulada por cambios en la concentración del Mg2+. 2) Por otra parte se determinó que la FBPasa activada por este sistema de modificación desarrolla una actividad SBPasa que presenta una actividad específica de un orden de magnitud menor respecto de la hidrólisis de la FBP, pero es del orden de las determinadas por otros autores para SBPasas específicas obtenidas de diferentes orígenes. Del mismo modo que la FBPasa, la SBPasa es activada por el Ca2+ y el sustrato, cuya concentración es modulada por el sistema de reducción. 3) La activación de la NADP-GAP deshidrogenasa depende de la de metabolitos (1, 3P2GA, NADPH, ATP, Pi), cuya concentración está modulada por luz. La tiorredoxina-f en presencia de DTT coopera en la activación concertada de la enzima. Dado que no se detectó cambio apreciable en los pesos moleculares de estas proteínas luego de la activación, se supone que la modificación en la actividad de estas tres enzimas se debe a una transición conformacional lenta entre un estado inactivo y uno activo. Particular atención se prestó en nuestros estudios a la modulación del Ca2+ sobre la actividad de la FBPasa y SBPasa. Este catión bivalente participa como activador en la fase de modificación de la enzima, en tanto inhibe la fase de catálisis. Ello condujo a postular que, de participar fisiológicamente en la regulación enzimática, debería existir una separación tempora] y/o espacial entre ambas fases dado el efecto dual del Ca2+ sobre estas enzimas. Esta suposición se sustenta en que el Ca2+ es requerido únicamente para la conversión de la enzima a su estado activo y no para la estabilidad de esta forma. Dado que la concentración de Ca2+ requerida para la activación de la FBPasa es mayor que la inhibitoria, se analizó si otros componentes participaban en este sistema de modificación. Las calmodulinas provenientes de diferentes fuentes activaron a la FBPasa sin disminuir la concentración de Ca2+ requerida como activador. Por ello se descartó su posible participación en la modulación de la FBPasa. Por otra parte, luego del tratamiento de la FBPasa con EGTA se separa una fracción que estimula la actividad específica en presencia de Ca2+ y FBP. Este factor disminuye en un orden de magnitud la constante de activación para el Ca2+ en la fase de modificación; además la concentración de Mg2+ requerida para el desarrollo de la catálisis es menor en comparación con la FBPasa que ha sido activada en ausencia del factor. Fracciones de las membranas tilacoides de los cloroplastos de espinaca y de membranas de cianobacterias (Nostoc muscorum) contienen una actividad similar. Notablemente, su efecto es independiente del sistema de reducción, ya que requiere solamente la presencia de Ca2+ y FBP en la fase de modificación de la FBPasa. En ensayos preliminares, las preparaciones de este factor activaron el sistema de oxidación del H20 en cianobacterias. A pesar de que este factor no está aún bien caracterizado, se pudo determinar que está formado por dos componentes: (A) con un peso molecular de 14.000-16.000 y susceptible a la digestión por subtilisina y (B) de peso molecular 1.500-4.000, el cual puede ser purificado por cromatografía líquida de alta presión.