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En el presente trabajo de tesis se evaluó la aplicación de biocatálisis en la transformación y síntesis de compuestos de muy diversa naturaleza con potencial utilidad para múltiples aplicaciones. Primeramente se propuso la aplicación de lipasas en la acilación selectiva de varios pregnanos hidroxilados en la posición 20. Los resultados obtenidos en este trabajo permitieron la preparación de nueve productos novedosos y la inclusión de un paso biocatalítico en la síntesis de 20ß-hemisucciniloxi-5aH-pregnan-3-ona, un intermediario en la síntesis de un conjugado esteroide-proteína. En segundo lugar se estudió la acilación quimioenzimática de quinicina. Este sesquiterpenoide natural ha mostrado interesantes propiedades en cuanto a su actividad biológica. Por otro lado posee una estructura muy compleja y lábil, con lo que su derivatización requiere de varias precauciones. La utilización de lipasas en este caso permitió la preparación de diez derivados, siete de ellos novedosos, de este producto natural. A continuación se describió la aplicación de células enteras de Rhodotorula minuta en la preparación de una serie de a-hidroxicetonas y a-dioles quirales. Estos compuestos son importantes en la preparación de bloques de construcción, auxiliares y catalizadores quirales. Finalmente se emplearon lipasas en la primera síntesis de poliamidoaminas lineales a partir de acrilato de etilo y N-metil-1,3-diaminopropano en un solo paso. En este caso, la capacidad de las lipasas para catalizar tanto reacciones de aminólisis como de adición de Michael permitió la obtención de un material polimérico altamente regular y monodisperso.

Una serie de aciloxi derivados de piridoxina (l), uno de los tres miembros del grupo de la vitamina B6, fueron preparados mediante reacciones de esterificación y transesterificación catalizadas por lipasas en medio orgánico. En las condiciones de trabajo, las lipasas mostraron un comportamiento altamente regioselectivo catalizando la acilación de piridoxina únicamente en la posición 5 del anillo piridínico. La misma clase de selectividad fue observada en la alcohólisis de derivados acetilados de l al emplear la lipasa de Candida antarctica (CAL). La metodología enzimática permitió la síntesis de once nuevos derivados de l, diez de ellos preparados a partir de ácidos grasos. Teniendo en cuenta la actividad tensioactiva, su composición y lo poco contaminante que resulta el método enzimático para su preparación, estos compuestos podrían ser útiles como ingredientes en formulaciones cosméticas o farmacéuticas o bien como aditivos alimentarios. Continuando el trabajo con lipasas, se describe un procedimiento enzimático muy eficiente para la preparación de carboxamidas N-sustituidas a partir de sus correspondientes ácidos carboxílicos. El procedimiento consiste en un solo paso e involucra la formación in-situ del éster etílico y la subsecuente aminólisis del mismo. La metodología resultó aplicable a una gran variedad de ácidos carboxílicos: de estructura lineal, cíclicos, saturados e insaturados, dicarboxílicos, con otros grupos funcionales presentes (hidroxiácidos), etc. Además, la enzima mostró un comportamiento selectivo frente a aminas con más de un grupo fiincional presente. Finalmente, se presenta la reducción enantioselectiva de cetoésteres catalizadas por células enteras. Como biocatalizador se empleó al hongo Mucor rouxii, un microorganismo dimórfico que puede desarrollarse como micelio o como levadura dependiendo de las condiciones de aireación del medio de cultivo. La morfología micelio catalizó el proceso de manera eficiente únicamente en agua, mientras que las levaduras, resultaron activas tanto en agua como en solventes orgánicos. Las esporas, producidas por el hongo como mecanismo de defensa y de preservación, también resultaron catalizadores eficientes y estereoselectivos del proceso reductivo. Asimismo, las técnicas de secado del microorganismo (liofilización y secado por corriente de aire caliente) resultaron muy convenientes para la conservación de la biomasa de Mucor rouxii. Las células de levadura liofilizada, rehidratadas en un pequeño volumen de agua, mantuvieron la misma eficiencia y selectividad en las reducciones en medio orgánico que los cultivos frescos durante al menos 4 meses.

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En Argentina se estima que la producción nacional de cebolla ocupa el tercer lugar, luego del poroto y la papa y alcanza las 450.000 toneladas anuales. Las principales zonas productivas son la región Norte (Santiago del Estero), las provincias de Mendoza y San Juan constituyen la región Oeste, y la región Sur, principal zona productora y exportadora, que comprende los valles irrigados del sur de la provincia de Buenos Aires y norte de la Patagonia así como parte de la zona pampeana. El destino de la producción es tanto para el mercado interno como externo, con Brasil y la Comunidad Europea como principales compradores. El cultivar "Valcatorce INTA", del tipo Valenciana, domina ampliamente la producción en todo el país. Las enfermedades que afectan al cultivo son el principal factor limitante para la producción y comercialización, la podredumbre basal de la cebolla causada principalmente por Fusarium oxysporum f.sp. cepae se considera la enfermedad clave del cultivo. De las variedades disponibles en el país, la más utilizada resulta ser sensible a esta enfermedad. A corto plazo, es decir en el mismo año de producción, reduce los rendimientos, afecta el valor comercial y aumenta los costos de producción por el uso de fungicidas. A largo plazo, se suma la pérdida de la productividad por acumulación del inóculo del patógeno en el suelo a causa de la repetición de cultivos de cebolla, y el incremento de enfermedades de postcosecha, que complican la comercialización. Entre los métodos de control para hongos del suelo, tal es el caso de Fusarium, una de las técnicas más utilizadas, y con muy buenos resultados, ha sido la desinfección de suelos con Bromuro de Metilo. El mismo se encuentra prohibido, a nivel mundial y en nuestro país, por el daño que generan sus emisiones gaseosas a la capa de ozono. Entre los métodos alternativos al uso de compuestos químicos, se puede nombrar al control biológico con uso de microorganismos antagonistas. Entre los hongos más utilizados se destacan especies del género Trichoderma, que se caracterizan por ser hongos filamentosos, oportunistas, simbiontes no patogénicos de plantas y que pueden funcionar como antagonistas de muchos patógenos de plantas, protegiéndolas de enfermedades. Poseen numerosos mecanismos de acción, entre ellos la competencia por espacio y nutrientes, la producción de metabolitos secundarios (antibiosis), el micoparasitismo y la resistencia inducida a las plantas. Dada la importancia de encontrar alternativas de manejo a la enfermedad, en este estudio regional, se planteó la obtención, identificación y caracterización cultural y fisiológica de 50 aislamientos nativos de Trichoderma sp. y su comparación con tres cepas comerciales, como potenciales antagonistas de aislamientos regionales de Fusarium sp. De cultivos comerciales de cebolla de dos zonas importantes de producción (Alto Valle de Río Negro y Neuquén y Valle Inferior del Río Negro), se obtuvieron aislamientos nativos del antagonista y del patógeno. Se identificaron los aislamientos de Trichoderma (n=50), por secuenciación parcial del gen TEF-1α como T. harzianum (22), T. longibrachiatum (16), T. citrinoviride (2), T. atroviride (1) T. gamsii (1) y Trichoderma sp (8). Por otro lado, por secuenciación del gen ITS y micromorfología, se identificaron como F. oxysporum f.sp. cepae a los aislamientos nativos más virulentos causales de la enfermedad. La capacidad antagónica de Trichoderma se evaluó in vitro frente a dos de los aislamientos más agresivos de F. oxysporum en cultivos duales, cultivos enfrentados y crecimiento a diferentes temperaturas. Se destacaron seis aislamientos nativos de Trichoderma por mayores porcentajes 1de inhibición del crecimiento del patógeno, mayor velocidad de crecimiento a 21°C y crecimiento negativo a 37°C. En invernadero, se evaluó la aplicación de estos 6 aislamientos para controlar la infección de F. oxysporum f.sp. cepae en los plantines de cebolla en los momentos de siembra y trasplante. En el primer caso, se destacó T. harzianum s.l. (T21) por colonizar las raíces de las plántulas de cebolla y presentar los mayores valores de disminución de la enfermedad (24,3%). Al momento del transplante, los valores de infección por el patógeno en ausencia de Trichoderma llegaron al 30%, mientras que en presencia del antagonista el porcentaje de infección disminuyó a valores cercanos al 15%. Además, el aislamiento nativo de T. harzianum s.l. (T21), se destacó por su efecto en el aumento del 40% en el peso fresco de las plantas. Por otro lado, el tratamiento inoculado con el aislamiento comercial “TC3” (Trichoderma atroviride), obtuvo un aumento importante en el peso fresco (43%) y largo de raíces. Se estudiaron los posibles mecanismos de acción de los antagonistas seleccionados. La prueba de uso de micoparasitismo como forma de control de patógenos dio negativa, por lo cual, no es uno de los mecanismos utilizados por estos aislamientos. Se observó una clara competencia por hierro, principalmente por el aislamiento T. harzianum s.l. (T21); y por fuentes carbonadas, no así cuando se evaluaron distintas fuentes nitrogenadas. Es por esto que se concluye que el mecanismo más utilizado durante el antagonismo es la competencia por espacio y nutrientes. Si bien se requieren de nuevas evaluaciones a campo, se demostró la capacidad de aislamientos nativos para controlar esta enfermedad en el cultivo de cebolla.

El Alto Valle de Río Negro es la principal región productiva de perales en Argentina con 22.728 hectáreas cultivadas, de las cuales el 46% es ocupado por el cultivar William´s. La podredumbre de cuello, corona y/o raíces en pomáceas, causada por Phytophthora cactorum es una de las enfermedades más importantes y ampliamente distribuida en el mundo, que causa pérdidas económicas significativas y culmina generalmente con la muerte del árbol. En esta región, no hay estudios a campo sobre la diversidad de especies de Phytophthora presentes en los cultivos y potencialmente patógenas de peral. Las principales formas de manejo de esta enfermedad incluyen el control químico con metalaxyl, clasificado como de alto riesgo en la inducción de resistencia en patógenos. El objetivo de esta tesis fue estudiar la ocurrencia y patogenicidad de diversas especies de Phytophthora asociadas al cultivo de peral y su control biológico con aislados de Trichoderma regionales, en plantaciones comerciales de cv. William´s de la zona del Alto Valle de Río Negro. Para ello se realizaron muestreos en otoño y primavera, seleccionando plantas con síntomas y el suelo circundante. El aislamiento de Phytophthora sp. se realizó desde madera en CMA-PARP y desde el suelo mediante cebos. Para aislar a Trichoderma sp. se seleccionaron plantas sanas en cercanías de plantas con podredumbre del cuello, y para su aislamiento se utilizó medio selectivo rosa de bengala. Todos los aislados de Phytophthora spp. fueron caracterizados por patogenicidad en frutos de pera y en brotes de dos cultivares susceptibles. Aislados representativos se identificaron por morfología y molecularmente como P. cactorum, P. inundata, P. lacustris, P. rosacearum y P. thermophila. Se seleccionaron por agresividad y frecuencia a 4 aislados de especies de Phytophthora que fueron evaluados en raíces de pie franco de peral. Las mismas causaron podredumbre en las raíces principales y secundarias. Se calculó la pérdida de raíces alcanzando un 98 % en el índice McKinney para P. cactorum. Del total de 78 aislados regionales de Trichoderma, 18 se identificaron molecularmente y seleccionaron por sus características antagónicas frente a 4 especies de Phytophthora. De ellos, 3 con mejores características antagónicas se evaluaron en un bioensayo frente a P. cactorum en plantas jóvenes de peral. Los aislados T. harzianum (T1330) y T. guizhouense (T1367) fueron capaces de reducir tanto preventiva como curativamente la podredumbre de cuello en peral, logrando hasta el 97 % de biocontrol.

La costa Patagónica se encuentra expuesta a la contaminación por hidrocarburos de origen antrópico, los cuales pueden persistir en los sedimentos costeros, sobre todo en regiones frías. La biodegradación mediada por bacterias autóctonas constituye un mecanismo importante de eliminación de estos contaminantes del medio ambiente. El objetivo general de esta Tesis fue incrementar nuestro conocimiento sobre las poblaciones bacterianas degradadoras de hidrocarburos alifáticos en sedimentos costeros crónicamente contaminados de ambientes subantárticos (Bahía Ushuaia, Tierra del Fuego). Para ello, se emplearon diferentes técnicas moleculares independientes del cultivo de microorganismos, basadas tanto en el análisis de genes marcadores funcionales, marcadores filogenéticos, así como también estrategias metagenómicas. Como marcador funcional se utilizaron los genes alkB, que codifican para la subunidad catalítica del complejo enzimático Alcano hidroxilasa AlkB, una familia de enzimas clave en el metabolismo aeróbico de alcanos. Se observó la existencia de una gran diversidad de variantes de genes alkB en los sedimentos de Bahía Ushuaia, con una predominancia de secuencias relacionadas al filo Proteobacteria, y Actinobacteria en segundo lugar. Al analizar una muestra representativa de sedimentos por secuenciación en gran escala de amplicones del gen para el ARN ribosomal 16S, se observó una comunidad dominada por géneros bacterianos conocidos por su capacidad de degradar hidrocarburos o que se han visto asociadas a la biodegradación a bajas temperaturas: Oleispira, Pseudoalteromonas, Glaciecola, y Psychrobacter. Asimismo, miembros del clado Roseobacter (Alphaproteobacteria), y del género Nocardioides (Actinobacteria) también fueron abundantes. Evaluamos la respuesta de la comunidad bacteriana frente a una exposición experimental a petróleo crudo con y sin el agregado de nutrientes. La comunidad bacteriana del sedimento respondió rápidamente, observándose cambios tanto a nivel funcional como estructural. A nivel funcional, se identificaron secuencias de genes alkB que pueden ser consideradas relevantes ecológicamente, y que pueden ser utilizadas para el desarrollo de herramientas moleculares de diagnóstico ambiental. A nivel estructural, sugerimos que los miembros del clado Roseobacter, Maribius (Alphaproteobacteria), junto con Nocardioides (Actinobacteria), serían importantes en los procesos de atenuación natural de hidrocarburos alifáticos en este ambiente. Luego del tratamiento con petróleo crudo y nutrientes, se produce un cambio drástico en la estructura de la comunidad bacteriana, seleccionándose predominantemente los géneros Alcanivorax (Gammaproteobacteria) y Thalassospira (Alphaproteobacteria). Asimismo, observamos el enriquecimiento de varios géneros que no habían sido reportados asociados a la biodegradación de hidrocarburos, en particular de los ordenes Caulobacterales y Flavobacteriales. La utilización de dos estrategias metagenómicas nos permitió seguir ampliando el espectro de diversidad de los genes alkB característicos de sedimentos de Bahía Ushuaia, y estudiar aspectos de la organización génica. En conjunto, nuestros resultados indican que la importancia de miembros del filo Bacteroidetes con respecto al potencial de biodegradación de hidrocarburos en ambientes costeros de zonas rías podría haber sido subestimada. Mediante la construcción y el análisis de una biblioteca metagenómica en fósmidos, se identificaron dos fragmentos genómicos (de longitud 33 kb y 38 kb), conteniendo secuencias AlkB de longitud completa y novedosas, como así también genes contiguos potencialmente involucrados en el metabolismo de alcanos y lípidos. Ambos fragmentos genómicos se encontraron relacionados con los genomas de miembros del filo Planctomycetes. No existían hasta el momento reportes de la presencia de genes que codifican para la degradación de alcanos en este grupo filogenético, el cual se encuentra aún muy poco estudiado. En resumen, el estudio mediante métodos independientes del cultivo de las comunidades microbianas de un ambientes frío crónicamente contaminado de la Patagonia, nos permitió la identificación de genes biomarcadores y microorganismos indicadores para la biodegradación de alcanos en estos ambientes, inferir su posible respuesta a la exposición a petróleo crudo y su comportamiento frente a la bioestimulación con nutrientes, así como también avanzar en el análisis del contexto genómico de algunos de estos genes en grupos microbianos ecológicamente relevantes pero aún poco conocidos.

Los materiales lignocelulósicos se explotan en industrias tales como la madera, el papel y la agroindustria, cuyos residuos podrían transformarse en productos utilizables por bioconversíón. Dentro de los hongos existen algunos con mayor capacidad degradativa de lignina, los que producen “pudrición blanca”. Uno de ellos es Trametes trogii. Experiencias previas en biopulpado con la cepa utilizada en este estudio, demostraron que reducía el consumo de energia y mejoraba la calidad del papel obtenido. Este trabajo se inició con el objetivo de comprobar si dicho hongo es capaz de producir enzimas lignocelulolíticas in vitro, las cuales podrían utilizarse en procesos de bioconversíón de materiales lignocelulósicos de desecho y otros procesos biotecnológicos. El mismo comprende la detección y el estudio de las enzimas involucradas en la conversión de materiales lignocelulolíticos por T. trogii (celulasas, xilanasas, pectínasas y enzimas que intervienen en la degradación de lignina), la investigación de las condiciones nutricionales y de cultivo que favorecen la producción de las distintas actividades enzimáticas, asi como una caracterización de dichas actividades enzimáticas en el extracto crudo. Previamente a la aplicación industrial de los hongos de pudrición blanca, es necesario investigar el proceso de degradación y como éste afecta a los diferentes tipos celulares, por ello paralelamente se realizaron ensayos de degradación sobre madera y analizaron los cambios estructurales y ultraestructurales producidos por la acción de T. trogii. Los resultados obtenidos permiten afirmar que T. trogii bajo condiciones adecuadas produce los sistemas enzimáticos extracelulares necesarios para degradar activamente los principales componentes de las paredes celulares de las plantas superiores. Teniendo en cuenta los altos títulos y la tolerancia a situaciones extremas registrados para algunas de dichas enzimas, se podría considerar que constituye una buena fuente para la obtención de los sistemas enzimáticos empleados en diferentes procesos de bioconversíón.

Este trabajo tuvo como objetivo caracterizar el biodeterioro de madera de Platanus acerifolia de la Ciudad de Buenos Aires, en relación con los agentes etiológicos, los endófitos fúngicos y las variables ambientales. Se muestrearon árboles asintomáticos y sintomáticos en 4 sitios de muestreo. Se obtuvieron 27 especies de endofitos, 5 correspondientes a basidiomicetes. Tres especies de basidiomicetes fueron obtenidas de árboles sintomáticos. Las identificaciones fueron realizadas por métodos morfológicos y moleculares. Phanerochaete chrysosporium y Nodulisporium (Xylariales) presentaron los mayores valores de degradación in vitro y de producción de oxidasas. Los análisis multivariados sugieren que la biodiversidad de endofitos está altamente influenciada por el disturbio antrópico. Se encontró una asociación positiva entre la edad de los árboles y la riqueza de endofitos y entre la presencia de basidiomicetes endofíticos y patógenos en cada sitio. La confrontación en cultivos duales entre xilófagos y micromicetes, indican que Trichoderma harzianum y el endofito Granulobasidium vellereum presentan la mayor capacidad antagonista. Las observaciones en microscopia óptica y electrónica de los patrones de deterioro indican que Bjerkandera adusta e Inonotus rickii causan una pudrición blanca. B. adusta degrada más extensamente que I. rickii, con un patrón de degradación simultanea. I. rickii produjo un patrón de delignificación selectiva. Los resultados indican que existen hongos colonizando madera sana que poseen el potencial de degradarla, apoyando la hipótesis de la “infección latente”.

En esta tesis doctoral se presentan los resultados obtenidos en el marco de la aplicación de dos herramientas importantes para ser tenidas en cuenta en el manejo, restauración y monitoreo de ecosistemas acuáticos contaminados por metales pesados: el Modelo del Ligando Biótico y la Fitorremediación, evaluadas en dos aguas naturales de nuestro país con características físico-químicas extremas, como lo constituyen las aguas del Río Pilcomayo, caracterizadas por los elevados valores de sus iones principales como por la gran carga de sólidos que transporta y las aguas del Arroyo Morales, afluente del Río Matanza-Riachuelo, caracterizadas por el elevado pH y elevada concentración de sodio y alcalinidad. El Río Pilcomayo presenta también una gran variación inter-estacional en su caudal que, de acuerdo al análisis realizado, afecta directamente la hidroquímica del río ya que los iones mayoritarios muestran una variación inter-estacional con valores superiores en la estación seca. Los sólidos totales en suspensión son mayores en la estación húmeda y constituyen los principales transportadores de los metales pesados que este río recibe provenientes de la actividad minera en su alta cuenca. El mecanismo determinante del contenido iónico en el agua del Río Pilcomayo en la cuenca baja es la evaporación-cristalización en ambas estaciones. Dado el efecto directo de la hidroquímica sobre la biodisponibilidad y toxicidad de los metales en los organismos acuáticos, se estudió la toxicidad aguda del cobre, cinc, cadmio y plata en la especie nativa Cnesterodon decemmaculatus, en agua del Río Pilcomayo y en agua del Arroyo Morales, que mostró el siguiente patrón: plata>cobre>cadmio>>cinc y en agua del Arroyo Morales; cobre>>cinc. La variable físico-química con mayor influencia sobre la toxicidad de los metales fue la dureza. Se aplicó el Modelo del Ligando Biótico a cada calidad de agua y cada metal para evaluar la validez de una extrapolación inter-específica de la predicción de toxicidad aguda del modelo para la especie P. promelas. La extrapolación mostró ser válida sólo para el cobre en agua del Río Pilcomayo, para el resto, el modelo tendió a sobrestimar la toxicidad. Esto podría deberse a las limitaciones del modelo en cuanto al rango de valores de los parámetros físico-químicos con los que ha sido calibrado, a que los individuos empleados en los ensayos constituían estadíos menos sensibles y/ó a la menor sensibilidad de C. decemmaculatus respecto a P. promelas a la presencia de los metales estudiados. La especie acuática flotante nativa Salvinia minima presentó una gran capacidad para remover nutrientes, cobre y cinc, tanto en medio de cultivo como en un agua natural como el agua del Río Pilcomayo, incrementándose el contenido del metal en la biomasa a mayor concentración del mismo en solución. La remoción de cobre fue fundamentalmente por biosorción. Esto permitiría una recuperación relativamente sencilla del metal removido. Asimismo, esta especie presentó una baja traslocación del metal a la biomasa aérea, evidenciando un efecto protector de la maquinaria fotosintética. Estas características hacen de esta especie una buena elección para el tratamiento de aguas y efluentes con elevados niveles de los nutrintes y metales estudiados. El trabajo realizado en esta tesis contribuye con la evaluación de herramientas que puedan ser aplicadas, en un futuro, en la generación de una normativa y en el manejo y monitoreo ambiental de las aguas basados en las características propias de nuestras especies y nuestros cuerpos de agua.