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Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019

La salinidad del suelo afecta a la producción agrícola limitando el crecimiento, el rendimiento y la calidad de los cultivos. La comprensión de los mecanismos de tolerancia a estrés salino es esencial para el mejoramiento genético de especies de interés destinadas a ambientes con dicha limitante. Lotus tenuis es una leguminosa forrajera perenne naturalizada en los campos bajos de la Pampa Deprimida argentina, considerada tolerante a la salinidad en estadios de germinación, plántula y planta adulta. Los mecanismos involucrados en la respuesta a estrés salino de la especie no han sido totalmente dilucidados. Se conoce que el antiporter vacuolar NHX1 es responsable de la compartimentalización de Na+ en vacuolas y, en numerosas especies, se considera fundamental en la tolerancia a la salinidad. El objetivo de la presente tesis doctoral fue estudiar la participación del antiporter vacuolar NHX1 de Lotus tenuis en su tolerancia a salinidad. Para esto, se determinó la expresión transcripcional relativa del gen LtNHX1 y de otros genes involucrados en el transporte y exclusión de sodio en genotipos contrastantes en su tolerancia al estrés, se determinó la localización subcelular del antiporter, y se estudiaron los cambios en la tolerancia a la salinidad de L. tenuis y de Arabidopsis thaliana a partir de la expresión constitutiva de la región codificante del gen. Se inició la investigación con la selección de genotipos de L. tenuis con comportamiento contrastante a la salinidad en fase vegetativa juvenil. Para esto, se evaluó el crecimiento de familias de medios hermanos (FMH) del programa de mejoramiento genético de la Unidad Integrada UNNOBA-INTA bajo distintas concentraciones salinas alcanzadas por aclimatación, en dos ensayos hidropónicos en condiciones semi-controladas. Debido a las condiciones ambientales y a la variabilidad intrafamiliar existente, el comportamiento de las FMH no fue consistente en las distintas evaluaciones. Por esto, los siguientes ensayos se realizaron en condiciones controladas con genotipos propagados vegetativamente y sin aclimatación al estrés. Se estimó un índice de tolerancia relativo y se evaluó la sobrevivencia a lo largo de tres ensayos, para finalmente seleccionar un genotipo tolerante a la salinidad proveniente de una de las FMH evaluadas previamente, y un genotipo susceptible proveniente del cultivar Pampa INTA. Posteriormente, con el fin de tener un conocimiento más acabado de los mecanismos de tolerancia a la salinidad de la especie, se compararon los contenidos de iones Na+ , K+ y Cl- , y la expresión transcripcional relativa de genes codificadores de transportadores de membrana, en distintos tejidos de los dos genotipos contrastantes bajo distintas concentraciones salinas y en distintos momentos. El agregado de sal incrementó los niveles de Na+ y Clen ambos genotipos. En raíz este incremento con respecto al control sin agregado de sal fue mayor en el genotipo tolerante. En parte aérea ocurrió lo contrario y fue el genotipo susceptible el que presentó mayores incrementos respecto al control sin sal. Esto podría indicar una exclusión de iones más eficiente, y un mayor secuestro de los mismos en las vacuolas de la raíz en el genotipo tolerante, contribuyendo a la mayor tolerancia mediante la reducción de la toxicidad iónica en la parte aérea. Los cambios en la expresión génica en las raíces apoyaron esta conjetura, debido a que el genotipo tolerante presentó un incremento en la expresión relativa de NHX1 (responsable de la compartimentalización de Na+ ), de SOS1 (relacionado con su exclusión); y de HKT1 (relacionado con la descarga de Na+ del xilema para evitar su transporte a la parte aérea). También se incrementó la expresión del gen del cotransportador CCC, posiblemente relacionado con la exclusión de Cl- . En el genotipo susceptible, el cloruro de sodio no produjo el incremento de los transcriptos de estos genes en raíz, aunque incrementó la expresión de NHX1 en hoja, lo cual resultó menos eficiente para disminuir los efectos tóxicos del Na+ que la compartimentalización en raíces presumiblemente realizada por el genotipo tolerante. En los dos genotipos se analizaron in silico las regiones 5‟ de LtNHX1, hallando en ambos casos posibles elementos reguladores relacionados con la respuesta a estrés salino y otros tipos de estrés abiótico. Se realizó el estudio de la ubicación subcelular de LtNHX1 mediante la expresión constitutiva de la proteína de fusión LtNHX1-GFP tanto en forma transitoria en Nicotiana benthamiana como en plantas transgénicas de L. tenuis. Se determinó que se trata de un antiporter NHX del grupo I, ubicado en membrana vacuolar. La expresión constitutiva de la región codificadora de LtNHX1 incrementó la tolerancia a la salinidad de una línea transgénica de A. thaliana en fase de germinación y en etapa vegetativa, tanto cuando el estrés fue impuesto por shock como por aclimatación. También se incrementó la tolerancia a la salinidad en etapa vegetativa de una línea transgénica de L. tenuis con sobreexpresión de LtNHX1. En conclusión, se confirmó que el antiporter NHX1 de L. tenuis se ubica en membrana vacuolar y participa en la tolerancia a la salinidad de la especie mediante la compartimentalización de Na+ en las vacuolas de las raíces, complementando la actividad de otros transportadores que reducen o retrasan el transporte de Na+ a la parte aérea de las plantas.

Losespermatozoidesde mamífero adquieren su capacidad fecundante después de una serie de modificaciones bioquímicas enel tracto reproductor femenino, colectivamente llamadas capacitación. Estos cambios son esenciales para que los espermatozoidespuedan realizarla exocitosis acrosomal (EA), un proceso que es fundamental para la fecundación. Eneste trabajo se estudiaron los cambios en el citoesqueleto de actina en la preparación para la ocurrencia de la EA así como también, los cambios enlosnivelesde calcio intracelular comoevento fundamental para laetapasfinalesde la fusión demembranas. La dinámica del citoesqueleto de actina juega un rol central en controlar el procesode exocitosis en células somáticas así como en los espermatozoides de varias especies demamíferos. A pesar de que en células somáticas, laspequeñas GTPasas de la familia Rho son ampliamente conocidas como reguladores principales de la dinámica dela actina, su función en espermatozoides esdesconocida. Enel presente trabajose caracterizó la participaciónde las pequeñas GTPasasde la familia Rho en la víade señalizaciónqueconducea la polimerizaciónde actina durante la capacitación del espermatozoide de ratón. Seobservó que la mayoría de las proteínas de esta cascadade señalización y sus proteínasefectoras se expresan en elespermatozoide de ratón. La activaciónde las víasde señalizaciónde AMPc/PKA, RhoA/C y Rac1 es esencial para la activación por fosforilación de LIMK1 en Treonina 508. Cofilin es fosforiladaen Serina 3porLIMK1 durante la capacitación de manera transitoria. La inhibicióndeLIMK1 por un inhibidorespecífico(BMS-3) resultó en menores niveles de polimerización de actinadurantela capacitacióny una marcada disminución en el porcentaje de espermatozoides que realizan EA. Asimismo se sabe que es necesario un aumento enel Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) para que laEAseproduzca. La progesterona producidaporlascélulasdelcúmulusha sido asociada con diversos procesos fisiológicos en los espermatozoides, incluyendo la estimulaciónde la EA. En este trabajo, investigamos la correlación espaciotemporal entre los cambios en el [Ca2+]iy la EAen espermatozoidesindividuales de ratón en respuesta a la progesterona. Se encontró que la progesterona estimula un incremento en el [Ca2+]i encinco patrones diferentes: gradual,oscilatorio, transitorio tardío, transitorioinmediato, y sostenido.Tambiénse observó que el aumento en el [Ca2+]ipromovido por la progesterona puedecomenzar tanto en el flagelo como en la cabeza del espermatozoide. Se validó lautilizaciónde FM4-64 como un indicadorde la ocurrencia de la EA mediante la detección simultánea del aumento de su fluorescencia yla pérdida del EGFP en espermatozoides transgénicos EGFPAcr. Por primeravez, selogró visualizar simultáneamente elaumentoenel [Ca2+]i y elproceso de exocitosis en respuesta a la progesterona, observándose que sólo un aumento transitorio específico en el [Ca2+]i originado en la cabeza del espermatozoide promueve lainiciación de la EA. En conclusión, en esta tesis selogró evidenciar laimportanciade las pequeñas GTPasasde la familia Rho ysusefectores principales LIMK1y Cofilin en laregulación de la dinámica del citoesqueleto deactina en la preparación del espermatozoidepara poder realizar la EA. A su vez, se identificó el tipo de aumento de [Ca2+]i específico que es necesario para iniciar los eventos finales de la EA estimulada por progesterona.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. INIMEC-CONICET-Universidad Nacional de Córdoba. 2013. 176 h. + CD; grafs.; tabls. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. INIMEC-CONICET-Universidad Nacional de Córdoba. 2013. 176 h. + CD; grafs.; tabls. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

Los ganglios de la base están constituidos por una serie de núcleos subcorticales bilaterales que forman un circuito altamente interconectado; poseen una estrecha relación anatómica y funcional con el tálamo y la corteza cerebral y han sido clásicamente involucrados en el control de la función motora. Los componentes principales de los ganglios de la base son el globo pálido, la sustancia negra, el núcleo subtalámico y el estriado. Este último es el principal núcleo de entrada de información a los ganglios de la base. Recibe aferencias glutamatérgicas excitatorias, topográficamente organizadas de prácticamente toda la corteza cerebral y varios núcleo talámicos. A su vez, la sustancia nigra pars compacta ejerce, mediante la proyección dopaminérgica nigroestriatal, un papel regulatorio sobre la actividad del estriado. Recientemente han surgido evidencias electrofisiológicas, comportamentales, bioquímicas y clinicas que sugieren la participación de los ganglios de la base en la nocicepción y específicamente en los mecanismos de modulación del dolor. Es asi que, con el objeto de ampliar los conocimientos referentes al rol funcional de los ganglios de la base en la neurofisiología del dolor, el objetivo de esta tesis doctoral fue el de estudiar la participación del estriado de la rata en el control de la nocicepción y los mecanismos de analgesia endógena. Para ello trabajamos sobre un modelo de dolor que caracterizamos y validamos: el reflejo de abertura bucal evocado por la estimulación nociceptiva de los incisivos inferiores en ratas anestesiadas. Empleando dicho modelo, pudimos demostrar que la activación tanto eléctrica como química (mediante microinyecciones intraestriatales de glutamato) de determinadas regiones del mismo resulta en una disminución significativa en la amplitud del reflejo. Por medio de registros extracelulares de neurona única (single unit) en los núcleos motor y sensorial del trigémino se pudo analizar el efecto inhibitorio del estriado sobre neuronas de la via del reflejo. De esta manera, demostrarnos que el efecto inhibitorio generado por la estimulación del estriado se debe a la modulación de las aferencias sensoriales y no a un efecto motor, como podría esperarse al tratar con los ganglios de la base. El análisis conjunto de los resultados expuestos en esta tesis nos lleva a considerar fuertemente la participación de los ganglios de la base en la modulación del dolor y en los mecanismos de analgesia endógena. De esta manera, los ganglios de la base no solo estarían involucrados en la coordinación e integración de la función motora con aspectos motivacionales y afectivos; sino que además, podrían promover respuestas fisiológicas adaptativas consecuentes con el plan motor seleccionado. La activación de los mecanismos de analgesia endógena podría formar parte de este proceso.

Bacilo Calmette-Guérin (BCG) es el tratamiento estándar para prevenir recidivas y progresión del cáncer vejiga (CaV) no invasor de alto grado histológico. Utilizando un modelo de CaV murino (MB49) demostramos que BCG reduce el crecimiento tumoral a través de a) la inhibición del crecimiento de las células tumorales y b) la generación de un estroma anti-tumoral. El crecimiento de células tumorales es inhibido por la activación del receptor activador de la proliferación de peroxisomas (PPARɣ) y la regulación negativa del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR3). BCG también induce la remodelación del estroma, incrementando la proliferación y diferenciación de los fibroblastos en forma directa o a través de factores producidos por los macrófagos. Este proceso es regulado negativamente por el óxido nítrico. Uno de los factores liberados por los macrófagos es el FGF-2, el cual induce esta activación de los fibroblastos. En tumores, se observa que BCG induce la disminución de la expresión del FGFR3 en las células tumorales y el incremento en la expresión de FGFR1 y FGFR2 en el estroma. En el 50% de los tumores de vejiga de pacientes, la expresión del FGFR3 disminuye por tratamiento ex vivo con BCG. El presente trabajo describe un nuevo mecanismo de acción de BCG, plantea nuevos blancos terapéuticos y posibles marcadores pronósticos para pacientes con CaV.

El parto es un proceso complejo, resultado de la delicada interconexión espacial y temporal entre los sistemas endocrinos materno y fetal. Los mecanismos precisos a través de los cuales ejercen su efecto las moléculas involucradas en el disparo del parto aún no han sido dilucidados. En el presente trabajo se investigó la participación de una de estas moléculas, el Factor de Crecimiento Epidermal (EGF) sobre el inicio del parto. En primer lugar se estudió el efecto del tratamiento intra-uterino (i/u) con EGF sobre el inicio del parto. Se realizó una curva dosis — tiempo — respuesta y se observó que la administración i/u de 500 ng de EGF en el día 21 de gestación retrasó 19.8 ± 0.7 h el inicio del parto con respecto a las hembras sham (hembras tratadas i/u con solución fisiológica). Por lo tanto, las hembras tratadas con EGF parieron el día 23 de gestación en lugar del día 22, como ocurrió en el caso de las hembras sham. Seguidamente se investigó el mecanismo por el cual el EGF exógeno modulaba el inicio del parto. Los resultados mostraron que 500 ng de EGF i/u administrados en el día 21 de gestación fueron capaces de: disminuir la síntesis de PGE2 y PGF2α en útero y en líquido amniótico; disminuir la expresión uterina de ambas isoformas de COX; aumentar la concentración de progesterona sérica y disminuir la fuerza de las contracciones miometriales. Los valores obtenidos para estas variables analizadas, fueron similares a los obtenidos en el día 21 de gestación para las hembras controles (día previo al inicio del parto), y recién en el día 23 de gestación (día del parto en las tratadas) alcanzaron el nivel obtenido durante el día 22 por las hembras sham. En la rata, el cuerpo lúteo es responsable de mantener la síntesis de progesterona indispensable para el éxito de la gestación, durante todo este proceso. Se ha postulado que a término, el aumento uterino de la expresión de COX-I y de la síntesis de PGF2α, desencadenaría el proceso luteolítico con la consecuente caída de la progesterona y el desencadenamiento del trabajo de parto. Dado que los resultados anteriores sugerían que el EGF podía estar ejerciendo su efecto a través de un mecanismo protector sobre el cuerpo lúteo, prolongando así la preñez, se procedió a analizar la morfología de los cuerpos lúteos de las hembras tratadas con EGF. Se observó que el tratamiento con 500 ng de EGF i/u en el día 21 de gestación, fue capaz de “re-luteinizar" el cuerpo lúteo, es decir que tomaron un aspecto similar al que poseen aquellos cuerpos lúteos con una alta capacidad de síntesis y secreción de progesterona. Los resultados hasta aquí descriptos, indican que el EGF exógeno estaría participando de los mecanismos moleculares involucrados en el inicio del parto, probablemente a través de un efecto inhibitorio sobre la luteólisis. Por último analizamos si el EGF endógeno participa en el inicio del parto. Se estudió la expresión uterina de los receptores de EGF, observándose una correlación temporal con el transcurso de la gestación. Además, analizamos la concentración de EGF en liquido amniótico y encontramos que este factor se encuentra aumentado en la mañana del día 21, sufriendo una abrupta caída doce horas después, correlacionándose con el aumento en la síntesis de la PGF2α, esencial para la luteólisis previa al inicio del parto.

El factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) es una citoquina pro-inflamatoria implicada en promover el crecimiento de ciertos tipos de cánceres. En el presente trabajo de Tesis se exploraron los caminos de señalización intracelulares que llevan al crecimiento de las células de cáncer de mama inducido por TNFα y su interacción con el receptor tirosina quinasa tipo I, ErbB-2. Nuestros resultados indicaron que el TNFα, actuando a través del receptor de TNFα tipo 1 (TNFR1), indujo la activación de las quinasas activadas por mitógenos p42 y p44 (p42/p44 MAPK), la quinasa del amino terminal de c-jun (JNK) y la fosfatidilinositol 3-fosfato quinasa / Akt (PI3-K/Akt), la activación del factor de transcripción Factor Nuclear κB (NF-κB) y la proliferación celular. También comprobamos que la administración de TNFα in vivo indujo el crecimiento del tumor C4HD en ratones Balb/c y que el tratamiento con un inhibidor selectivo de NF-κB, Bay 11-7082, resultó en la regresión parcial de dicho tumor de mama. Asimismo, el Bay 11-7082 bloqueó la capacidad del TNFα de inducir el aumento de la proteína promotora del ciclo celular ciclina D1 y de la proteína antiapoptótica Bcl-XL. Un importante hallazgo fue demostrar que el TNFα indujo la transactivación de ErbB-2 en células de cáncer de mama que sobreexpresan ErbB-2. En estas células, el TNFα activa a la tirosina quinasa c-Src, promueve la fosforilación de ErbB-2 en el residuo Tyr877, y favorece la formación del heterodímero ErbB-2/ErbB-3. Este último proceso lleva a la fosforilación de Akt, a la activación del factor de transcripción NF-κB, y al aumento en la expresión de ciclina D1. La presencia del inhibidor de ErbB-2, AG825, o de ARN cortos de interferencia (siRNA) contra ErbB-2, pero no la del anticuerpo monoclonal humanizado trastuzumab (HerceptinMR) abolió la fosforilación de ErbB-2, la activación de NF-κB y la proliferación inducidas por TNFα. Nuestro trabajo revela que el TNFα es capaz de transactivar a ErbB-2 y utilizarlo como un intermediario en la generación de señales mitogénicas. Dado que el TNFα se encuentra presente en un alto porcentaje de cánceres de mama, nuestros hallazgos tendrían una gran importancia en la comprensión de la biología de tumores de mama que sobreexpresan ErbB-2 como así también en la elección del tratamiento al cual los pacientes son sometidos.

Fil:Otero Corchón, Verónica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.