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La memoria de largo término y la plasticidad neuronal comparten varias características,incluyendo las fases temporales de mecanismos celulares y moleculares: la inducción requiere de un aumento de calcio intracelular, la persistencia temprana depende de la activación de quinasas y las etapas tardías necesitan de transcripción génica y de la síntesis de proteínas. Desde los primeros experimentos en los cuales se logro amnesia inhibiendo la síntesis proteica, se especula acerca de la función de factores de transcripción (FT) específicos, en la regulación de la expresión génica necesaria para la perdurabilidad tanto de fenómenos mnésicos como de la plasticidad neuronal. Este trabajo se concentro en dos aspectos de la función del FT NF-kappa B en la consolidación de la memoria de largo término y la plasticidad neuronal. El primer aspecto se refiere a la activación del FT luego de inducidos estos fenómenos, y el segundo a la conservación evolutiva de la función de esta vía de transducción desde crustáceos a mamíferos. Para los propósitos de este trabajo se evaluó la activación de este FT en tres modelos: la consolidación de la memoria de largo termina (MLT) en el cangrejo Chasmagnathus granulatus, un paradigma evitación inhibitoria en ratón y la inducción de potenciación de largo término in vivo de la vía perforante del hipocampo de ratón. La presencia de la vía de regulación transcripcional Rel/NF-kappa B, se determinó en el cangrejo por retardo electroforético (EMSA), Western Blot, inmunoprecipitación, unión covalente con irradiación ultravioleta e inmunohistoquímica. En el cangrejo, un protocolo que induce una MLT es seguido por una activación bifásica de unión al ADN por parte del NF-kappa B, mientras que un protocolo que induce una memoria de corto término no activa al FT. NF-kappa B se encuentra presente en las terminales sinápticas, en donde es activado por protocolos de entrenamiento que inducen MLT. El curso temporal de la activación de NF-kappa B nuclear en hipocampo, se estudió por EMSA, después del entrenamiento de un ensayo, en el paradigma de evitación inhibitoria en ratón. Mostrando, cuando se lo comparo con los animales naive, una inhibición del FT luego de 15 min. del entrenamiento seguida por una activación a los 45 min. tanto en los animales que sufrieron un shock eléctrico, como en los que fueron expuestos al contexto sin shock. En esta misma línea argumental, encontramos que la inyección intra cerebro ventricular (icv) de sulfasalazina inmediatamente post-entrenamiento impide la formación de la memoria de largo término. Más aún, una segunda estrategia independiente para inhibir el NF-kappa B en el cerebro, la administración icv de un oligonucleótido doble cadena de ADN conteniendo la secuencia consenso de NF-kappa B (kB Decoy) también resulta amnésica. Cuando se estudian los EMSAs de extractos nucleares de hipocampo de ratón, se observa que animales tetanizados (protocolo inductor de potenciación de largo término) muestran, luego de 15 min. un aumento en la actividad de unión al ADN, cuando son comparados con, animales estimulados a baja frecuencia (EBF) y animales naive. Los hipocampos al ser analizados por inmunohistoquímica con un anticuerpo contra la forma activa del factor, muestran la misma tendencia general pero con patrones celulares de activación más complejos. Estos resultados indican, primero que la actividad de unión al ADN del NF-kappa B es necesaria para la consolidación de memorias de largo término. Y el tratamiento con inhibidores específicos de NF-kappa B, suficiente para generar amnesia en los animales inyectados. A la vez que muestra un patrón temporal claramente delimitado en el cual el factor es necesario para la consolidación. Igualmente significativa es la activación del FT luego de inducida la plasticidad neuronal, mostrando un papel en el proceso de potenciación. El segundo aspecto de este trabajo sugiere que la vía de transducción señales de NF-kappa B se encuentra conservada, en su función fisiológica en el sistema nervioso, entre invertebrados y vertebrados.

Al presente se ha acumulado evidencia suficiente como para posicionar las galectinas (Gals) dentro de los principales mediadores de la respuesta inmune innata y adaptativa. Por lo tanto, resulta crucial entender cómo las Gals participan en el control de la homeostasis celular del sistema inmune y los mecanismos subyacentes. En la presente Tesis, describimos por primera vez un efecto activador de Gal-1 sobre células T naïve, lo cual queda demostrado por la inducción de co-estimulación y proliferación, esta última inducida en forma de quimera Gal-1-8-1. El bloqueo de las vías de señalización establecidas del TCR inhibió la co-estimulación inducida tanto por Gal-1 como Gal-8, lo cual indica que en realidad estas Gals actúan potenciando las señales débiles de respuestas bordeline del TCR. A pesar de que las células T CD4 constituyen las células blanco del efecto co-estimulador, tanto Gal-1 como Gal-8 tienen que unirse a las CPA y a las células T CD4 de manera simultánea en presencia del antígeno en el modelo de coestimulación. El hecho de que Gal-1 y Gal-8 estimulen las células T en reposo, pero que ejerzan un efecto anti-proliferativo luego de que éstas se activan, propone un rol dual para estas lectinas: por un lado aumentando las respuestas inmunes normales o fisiológicas; y por otro, restringiendo la fase efectora de las respuestas en curso o exacerbadas. Cuando estudiamos la participación de ambas Gals en el inicio de la respuesta inmune in vivo, observamos que una única dosis de Gal-1 o Gal-8, administrada junto con una dosis subóptima de antígeno, fue suficiente para aumentar la respuesta celular T. Además, la administración de Gal-8 en conjunto con el virus de aftosa inactivo (VFA), aumentó la respuesta humoral y de neutralizantes, lo cual se tradujo en un aumento en el porcentaje de protección. En el caso de la inmunización usando Gal-1, no se observaron diferencias en el título de anticuerpos específicos. Por otro lado, encontramos que la respuesta humoral específica contra VFAi inducida por Gal-8 se encontraba acompañada por un aumento en la respuesta celular temprana. En conjunto, nuestros hallazgos demuestran que una única dosis de antígeno VFAi formulado con Gal- 8 desata una respuesta inmune efectiva que protege contra el desafío con virus homólogo,lo cual permite postular esta Gal como potencial adyuvante en algunas preparaciones vacunales. En esta Tesis, describimos por primera vez un efecto activador de Gal-8 sobre células dendríticas (CD), evidenciado por un aumento en la expresión de moléculas coestimuladoras, una mayor capacidad de presentación antigénica, el desarrollo de un fenotipo típico de una CD madura, y una fuerte producción de IL-6. Con respecto a las CD, observamos que éstas también expresan mayor cantidad de Gal-8 luego de su activación. Más aún, las CD provenientes de ratones KO Gal-8-/- expresan menores niveles de CD86 luego de la activación, y además, son menos eficientes a la hora de estimular la proliferación de linfocitos T. En conjunto, el aumento en la expresión de Gal-8, puede constituir un mecanismo endógeno para amplificar el inicio de la respuesta inmune en el sitio de inflamación.

El oviducto de los mamíferos actúa como un reservorio funcional de espermatozoides proveyendo un ambiente que permite su mantenimiento y competencia para la fecundación del oocito. La unión de los espermatozoides con las células epiteliales del oviducto (CEO) prolonga la vida del espermatozoide, retrasando la capacitación, hasta que señales asociadas a la ovulación inducen su liberación. Varias moléculas del fluido oviductal participan en la regulación de la interacción espermatozoide-oviducto. La anandamida es un endocannabinoide que actúa a través de los receptores cannabinoides y ha sido detectada en el fluido oviductal. Previamente demostramos que la anandamida induce la liberación de los espermatozoides de las CEO en bovinos. En este trabajo estudiamos la regulación y el mecanismo de acción de la anandamida en este proceso. Se caracterizó la principal vía metabólica de la anandamida durante el ciclo estral en el oviducto bovino, encontrándose que tanto las CEO como los espermatozoides expresan a las enzimas del metabolismo de la anandamida. Además la mayor concentración de anandamida en el fluido oviductal bovino fue detectada en el momento peri-ovulatorio, siendo el estradiol la hormona involucrada en la vía de activación de este endocannabinoide. Asimismo la anandamida indujo la capacitación espermática y la liberación de los espermatozoides de las CEO a través de los receptores CB1 y TRPV1 con un incremento de Ca2+ espermático. En conjunto, proponemos que en el momento peri-ovulatorio, las hormonas ováricas podrían inducir un incremento de anandamida oviductal favoreciendo la capacitación espermática con la consecuente liberación de los espermatozoides del reservorio oviductal.

La anandamida (AEA), el endocannabinoide más abundante en el tracto reproductivo, es un importante mediador de los procesos de implantación y desarrollo embrionario pero niveles elevados de esta molécula en el útero son perjudiciales. A su vez, el óxido nítrico (NO) y las prostaglandinas (PGs) están involucrados en la reabsorción embrionaria (RE) inducida por lipopolisacárido (LPS). En varios trabajos se ha descripto que el LPS modula la producción de AEA y que ésta interacciona con el NO y las PGs. Por ello, estudiamos si este endocannabinoide estaba implicado en la RE inducida por LPS en el útero y la decidua de ratón durante la preñez temprana, evaluando su participación en un modelo in vitro. Observamos que tanto en el útero como en la decidua, el LPS tiene importantes efectos sobre el sistema endocannabinoide (SEC) modulando la síntesis y la degradación de AEA y la expresión de los receptores de estos compuestos (receptores de cannabinoides, CB). Demostramos también que la AEA induce su propio catabolismo en la decidua. Por otro lado, encontramos que la AEA media el efecto estimulatorio del LPS sobre la síntesis de NO y la expresión de la NO sintasa inducible (NOSi), a través de sus receptores específicos. También hallamos que la AEA participa en la modulación que ejerce el LPS sobre el camino biosintético de las PGs, hecho que puede contribuir a la contracción miometrial que favorece la expulsión de los fetos en un proceso de sepsis. Se estudiaron distintas enzimas del camino biosintético y del metabolismo de las PGs, y se observó que la AEA aumenta la expresión de la Ciclooxigenasa-2 (COX-2) mientras que inhibe la de la PGE sintasa microsomal 1 (PGESm-1) e incrementa la síntesis del metabolito de PGE2 (PGEM). Por otro lado, el efecto deletéreo de la endotoxina sobre los tejidos estudiados pudo ser bloqueado en parte cuando se co-incuba con antagonistas de los receptores de cannabinoides, sugiriendo que estos compuestos son parte del mecanismo de acción del LPS.

Los mecanismos neurobiológicos asociados al aprendizaje y la memoria han sido principalmente estudiados basados en episodios puramente aversivos o apetitivos. Mediante esa estrategia se identificó en distintos modelos artrópodos, incluyendo insectos y crustáceos, que el neurotransmisor dopamina señaliza los estímulos aversivos mientras el neurotransmisor octopamina participa en la señalización de los apetitivos. En este trabajo he desafiado este enfoque teniendo en cuenta que en la vida real los estímulos que un animal aprende a reconocer y en base a los cuales toma decisiones, predicen en muchos casos consecuencias apetitivas y aversivas. En este contexto planteé que la interacción entre la información apetitiva y aversiva contenida en una experiencia debe ser un proceso intrínseco de los procesos de aprendizaje y memoria. Con el objetivo de explorar esa hipótesis me propuse estudiar si la dopamina, además de responsable de señalizar los estímulos aversivos, afecta la formación de una memoria apetitiva, y en qué medida ese efecto representa la situación en la cual un estímulo aversivo interfiere un aprendizaje o memoria apetitiva. Para esto, utilicé 3 modelos animales distintos, bien descritos en la bibliografía, el cangrejo Neohelice granulata, la abejas Apis mellifera y la mosca Drosophila melanogaster que me permitieran estudiar cierta universalidad de los conceptos abordados. Para el diseño y realización de los experimentos aproveché las ventajas experimentales que brinda cada uno de estos modelos para contestar preguntas relacionadas con la representación neuroquímica de los estímulos que subyacen a la formación de la memoria. Realicé experimentos comportamentales combinados con manipulación farmacológica y genética para estudiar la interacción entre memorias apetitivas y aversivas. Además, realicé una descripción neuroanatómica del sistema dopaminérgico en abeja y en cangrejo. A partir de los resultados obtenidos puedo concluir que la dopamina, no solo instruye la formación de la memoria aversiva sino que también interfiere con la memoria apetitiva. También comprobé que luego de una experiencia mixta en la que dos estímulos incondicionados opuestos se asocian a un mismo contexto, se conforman dos memorias independientes que compiten en el momento de la expresión. La memoria que se expresa depende del balance entre la fuerza de los estímulos incondicionados y de factores motivacionales al momento de la evocación. Esto otorga al sistema un gran valor adaptativo, ya que, tras situaciones de aprendizajes con estímulos incondicionados contradictorios los animales establecen memorias que pueden ser alternativamente expresadas dependiendo de necesidades específicas del momento.

El propósito general del presente trabajo de Tesis Doctoral fue estudiar la participación de la ET-1 endógena en el desarrollo de HC inducida por Ang II así como las vías de señalización intracelular involucradas. En virtud de los antecedentes expuestos se elaboró la siguiente hipótesis: la HC patológica se produciría como resultado de la activación de un mecanismo autocrino/paracrino desencadenado por el estiramiento del miocardio y que involucra la liberación de Ang II y ET-1, el aumento de las ERO y la activación del NHE-1. La figura 8 muestra la secuencia propuesta de los eventos que se desencadenarían en los miocitos cardíacos adultos cuando son expuestos a Ang II y/o ET-1.

Cuello, Héctor Adrián. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Oncología Molecular

Fil:Campos, María Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Ladizesky, Marta Graciela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En los mamíferos, la regresión luteal o luteólisis es un evento determinante para el proceso reproductivo ya que garantiza la finalización de un ciclo no concepcional, permitiendo el inicio de otro ciclo potencialmente fértil. Estudios recientes demostraron la acumulación de leucocitos durante la luteólisis, asociada a la producción de citoquinas pro-inflamatorias y radicales libres. Es por esto que el objetivo del presente trabajo de tesis fue estudiar la participación de la Interleuquina-1 beta (IL-1β) en la luteólisis funcional. Además, dado que inhibidores de la NOS prolongan la vida del CL, se analizó si el óxido nítrico (NO) estaba involucrado en el mecanismo de acción de la IL-lβ. Para ello, se utilizó el modelo de la rata pseudopreñada, en el cual la administración de PMSG induce la formación de CLs con una vida media de aproximadamente lO días. Al comparar el CL en regresión (día 9 de psp) respecto del CL funcional (día 5 de psp) se observó que durante la luteólisis espontánea aumentó la producción endógena de IL-lβ y de PGF2α, mientras que disminuyeron la biosíntesis de P, los niveles del mRNA y de la proteína StAR y el contenido de glutation reducido (molécula antioxidante). La IL-Iβ fue capaz de reducir la biosíntesis de P y de aumentar la producción de PGF2α, incrementando los niveles proteicos de la COX-II pero no los de COX-I, enzimas responsables de la síntesis de PGs. Además, la IL-lβ moduló el estado oxidativo del CL funcional ya que aumentó el índice de lipoperoxidación (TBARs) y redujo el contenido de glutation reducido. Por lo tanto, la incubación de los explantes ováricos (día 5 de psp) en presencia de la IL-lβ reprodujo, en los CLs funcionales, las características observadas en los CLs en regresión sugiriendo que la IL-lβ promueve la luteólisis funcional. Mientras que los niveles del mRNA de la iNOS aumentaron en el CL en regresión, el contenido del mRNA de la eNOS disminuyó en un 50% en el día 9 de psp. A su vez, la producción de NO fue mayor en el CL en regresión, evidenciando la presencia de un sistema generador de NO en los explantes ováricos en las distintas etapas del desarrollo luteal. La IL-lβ estimuló la síntesis de NO y la incubación con el sustrato de la NOS, la L-Arginina, disminuyó la síntesis de P y aumentó la de PGF2α. Por otro lado, la presencia del L-NAME revirtió los efectos inducidos por la IL-lβ, indicando que el NO estaría involucrado en el mecanismo de acción de la citoquina. La activación de la iNOS sería un evento necesario en la acción biológica de la IL-lβ, ya que la citoquina aumentó la expresión del mRNA y de la proteína iNOS, mientras que el 1400W, inhibidor selectivo la iNOS, revirtió completamente su acción sobre la P. La acumulación de GMPc se incrementó por el tratamiento con IL-lβ y, mientras que el 8-Bromo-GMPc, un análogo del GMPc, disminuyó la biosíntesis de P, la presencia del inhibidor de la guanilato ciclasa soluble, el ODQ, anuló la reducción en la esteroidogénesis inducida por la IL-lβ .Estos resultados sugieren que el GMPc participa en el mecanismo de acción de la IL-lβ. Más aún, dado que el ODQ anuló el efecto antiesteroidogénico inducido por la L-Arginina, el GMPc sería un intermediario necesario en el efecto inhibitorio del NO sobre la biosíntesis de P. Los resultados del presente trabajo de tesis sugieren que la IL-Iβ participa en la luteólisis funcional a través de un mecanismo que involucra al NO, la isoforma iNOS y el GMPc.