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La tuberculosis (TB) es una enfermedad inflamatoria crónica causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Al comienzo de una infección por micobacterias, la activación de las células de la inmunidad innata (linfocitos Natural Killer (NK), Tγδ y polimorfonucleares neutrófilos (PMN), asi como las citoquinas (CK) secretadas por ellas, influencian y modulan el curso de la reacción inflamatoria. Los PMN participan en la formación del granuloma, precediendo a los monocitos en las áreas de inflamación granulomatosa, liberando quimioquinas (QK) que atraen a los monocitos activándolos indirectamente. A pesar de que, durante el curso crónico de la TB humana, la respuesta inflamatoria se caracteriza por un infiltradode monocitos-macrófagos en el sitio de infección pulmonar, a medida que la enfermedad avanza se puede observar un elevado número de PMN en el lavado broncoalveolar (BAL)que se correlaciona con el contenido de interleuquina (IL)-8 en pulmón. Esta CK, cuya producción por el macrófago es inducida por interleuquina (IL)-1β y factor de necrosis tumoral (TNF)-α, podria inducir a su vez la secreción de otras CK por el PMN. Por otra parte, se ha demostrado que, dentro de las lesiones pulmonares, los PMN son capaces de matar a la micobacteria. Luego de arribar al foco inflamatorio, los PMN subyacen a la muerte. Esto puede ocurrir por dos mecanismos de muerte: 1) necrosis: donde la liberación del contenido citoplasmático al medio extracelular provoca una respuesta de tipo inflamatoria, 2) apoptosis: donde la membrana permanece intacta, de manera que los neutrófilos son removidos por los macrófagos sin liberar su contenido. Además, cuando los macrófagos ingieren células apoptóticas, no liberan mediadores pro-inflamatorios pero si en cambio moléculas de acción anti-inflamatorias. Por otra parte, los PMN apoptóticos pierden previamente la habilidad de degranulación, fagocitosis, estallido respiratorio y quimiotaxis. Por eso, si bien los PMN juegan un rol central en la defensa contra microorganismos infecciosos, la presencia de estas células en el pulmón puede contribuir a la injuria tisular local y en este contexto, la muerte del PMN por apoptosis, representa un mecanismo que permite su reconocimiento e ingestión por los macrófagos residentes, limitando asi el daño tisular que genera el marcado influjo de PMN durante el curso de una infección bacteriana. El objetivo de este trabajo fue estudiar el estado de activación de los PMN circulantes en pacientes con TB (TB-PMN) y su posible contribución a la fisiopatología de esta enfermedad. Por otra parte, sabiendo que muchas funciones que dependen de la activación del PMN generan en éste señales intracelulares, que estarían asociadas a la inducción del proceso apoptótico en los PMN, estudiamos la apoptosis en los PMN circulantes y el proceso apoptótico espontáneo e inducido por Mtb in vitro evaluando a su vez los mecanismos involucrados en este fenómeno y las señales intracelulares que participan. Por último, para corroborar los experimentos in vitro, evaluamos los mismos parámetros en líquidos pleurales de pacientes con TB y patologías no relacionadas. Los resultados demuestran que: ▪ Los polimorfonucleares neutrófilos circulantes de pacientes con TB (TB-PMN), tienen aumentada la expresión del receptor para la fracción constante de la inmunoglobulina G (FcγR)-IIIB(CD16) y el receptor para TNFα de 55 kD (TNF-R55). A su vez se observó la expresión del FCγRI (CDG4)que no se expresa constitutivamente en PMN. En concordancia con el aumento en la expresión de los receptores CD16 y CD64, las funciones que de ellos dependen tales como citotoxicidad mediada por complejos inmunes (Cx-CI) y citotoxicidad dependiente de anticuerpos (CCDA), también se hallaron aumentadas en los TB-PMN. ▪ Por otra parte, en los TB-PMN la liberación de anión superóxido fue inducida a concentraciones quimioatractantes del péptido formilado FMLP. Estos resultados sugieren que los PMN de los pacientes con TB se encuentran activados y liberando intermediarios reactivos del oxigeno, fuera del sitio de infección. Por lo tanto la activación de los PMN en sangre periférica observada en los pacientes, puede ser considerada como una inflamación sistémica, contribuyendo a la fisiopatología del proceso crónico inflamatorio en tuberculosis. ▪ En circulación los PMN de los pacientes con TB no presentan signos de apoptosis. Los TB-PMN tienen mayor expresión de los receptores CD16 y CD11b, ambos son parámetros indicativos de la activación del PMN. ▪ Los TB-PMN presentan una apoptosis espontánea aumentada que se correlaciona con la pérdida espontánea del receptor CD16 en cultivo (marcador de apoptosis en PMN). La marcada apoptosis espontánea podria explicarse por la mayor expresión en membrana de la proteína pro-apoptótica Fas y una menor expresión de la proteina anti-apoptótica bcl-2 en citoplasma. ▪ Mtb activa a los PMN in vitro incrementando la expresión de CD11b tanto en N- como en TB-PMN y dicha activación aceleraría el proceso apoptótico in vitro. Más aún, observamos que los PMN activados se ubican en una zona de mayor tamaño celular y mayor expresión de CD11b. Este hecho, nos permite postular que la mayor apoptosis espontánea observada en los TB-PMN, podría deberse al estado de activación que in vivo presentan los PMN de pacientes con TB. ▪ La apoptosis inducida por Mtb en los TB-PMN está inicialmente retrasada. Este hecho se correlacionó con la conservación del receptor CD16 y una mayor producción de IL-8. A períodos mas prolongados, Mtb aceleró significativamente la apoptosis en los pacientes. ▪ El componente del Mtb causante del efecto apoptótico, no seria manLAM ni estaría presente en el el lisado total bacteriano de la cepa virulenta Rv utilizada en este trabajo, ya que no indujeron apoptosis comparable con la bacteria entera. El efecto pro-apoptótico del Mtb ocurre aún a relaciones no fagocíticas (Mtb:PMN, 1:3). Por lo tanto, el Mtb entero dispararía el proceso apoptótico sin necesidad de ser fagocitado. ▪ La apoptosis no está mediada por el TNFα endógeno y no involucra al receptor CD11b. ▪ La apoptosis inducida por Mtb en TB-PMN es dosis dependiente. A pesar de que la fagocitosis de la bacteria induce el proceso apoptótico en PMN, nosotros mostramos que la apoptosis es inducida también a bajas relaciones Mtb:PMN(1:3). Por Io tanto, La apoptosis inducida por Mtb ocurriría mediante la interacción de la bacteria con un receptor diferente del CD11b sin mediar fagocitosis. ▪ Analizamos la activación de ciertas kinasas tales como mitogen-activated-protein-kinasa (MAPK)p38 que en los PMN estaría asociada tanto a la activación celular como al proceso apoptótico y extracelullar-signal-regulated kinase (ERK) ERK1/2 asociada a la sobrevida. Observamos que p38 MAPK participa en la apoptosis mediada por Mtb, pero no en la apoptosis espontánea. Por otro lado, la activación de ERK sería necesaria para prevenir el proceso apoptótico ya que al inhibirla se indujo un aumento en la apoptosis. Esto hecho, podría deberse a la anulación de alguna señal anti-apoptótica que actúa por esta vía, como por ejemplo la IL-8. ▪ La expresión de Ia MAPK p38 fosforilada (activada) se encontró elevada en los TB-PMN circulantes respecto de PMN de individuos sanos o de patologías inflamatorias no relacionadas. Además, Mtb es capaz de inducir la expresión de p-p38 MAPK. ▪ Finalmente, evaluamos los parámetros de activación y apoptosis de los PMN en líquidos plurales. Observamos que los PMN presentes en líquidos pleurales de pacientes con tuberculosis, presentan un aumento en la expresión de los marcadores de activación, CD64, CD11b, TNF-R55 y una disminución del CD16, respecto de sangre periférica del mismo paciente. Basados en los experimentos in vitro, evaluamos si los PMN, una vez extravasados al sitio de infección, presentaban una grado de apoptosis mayor. Efectivamente, los PMN de los derrames pleurales tuberculosos tienen elevados niveles de apoptosis, no observándose el mismo efecto en derrames pleurales de patologías no relacionadas, a la vez que tienen una elevada expresión de la proteína p38 activada, por lo que concluimos que el fenómeno es característico de la enfermedad tuberculosa. Se sabe que en el contexto de una reacción inflamatoria pulmonar, el reclutamiento masivo de los PMN al foco infeccioso genera un daño tisular importante. Para evitar tanto el daño tisular como para resolver el proceso inflamatorio, es necesario remover oportunamente a estas células del pulmón. Por lo tanto, si la respuesta inflamatoria mediada por los PMN es regulada por la activación del proceso apoptótico se estaría controlando su potencial destructivo en el sitio de infección. En este trabajo demostramos que los PMN están activados antes de arribar al foco infeccioso y una vez allí, el encuentro con el Mtb dispararía una serie de señales que, moduladas a su vez por las CK presentes, activarían aún mas al PMN, como lo hemos observado en los derrames pleurales de etiología tuberculosa. Sin embargo, en un primer momento la apoptosis de los PMN extravasados sería contrarrestada por ciertas citoquinas como la IL-8, de manera tal, que en presencia del Mtb conservarían ciertos receptores, como el CD16, permitiendo al PMN extravasado mantener su capacidad efectora en el sitio inflamatorio. Posteriormente, la apoptosis inducida por el Mtb en los PMN se acelerarla rápidamente, promoviendo así la remoción de los PMN por los macrófagos alveolares y el control del proceso inflamatorio en el sitio de infección, lo que evitaría un mayor daño tisular.

Los mecanismos por los cuales los estrógenos y los progestágenos, a través de sus respectivos receptores (RE y RP), participan en el desarrollo y crecimiento del cáncer de mama es un tema controversial y de gran interés. La detección de estos receptores se utiliza como factor pronóstico y direcciona la terapéutica hacia una de tipo hormonal, dirigida principalmente a bloquear la fuente de estrógenos o inhibir la acción del RE. Sin embargo, han aparecido en los últimos años numerosas evidencias que implican a los RP en el desarrollo y progresión de carcinomas mamarios. En nuestro laboratorio se ha desarrollado un modelo experimental de adenocarcinomas mamarios murinos inducidos por la administración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Se establecieron líneas tumorales hormono-dependientes (HD) y hormono-independientes (HI) que expresan RE, α y beta, y las dos isoformas del RP (RPA y RPB). Se ha demostrado que el RP es fundamental en el crecimiento de estos tumores, tanto en los HD como en los HI. El tratamiento con antiprogestágenos u oligonucleótidos antisentido para el RP, inducen regresión de ambas variantes tumorales. Paradójicamente los estrógenos inducen regresión tumoral, mientras que el tamoxifeno inhibe el crecimiento tumoral. En estudios preliminares observamos que el antiestrógeno puro ICI 182.780, inhibe in vitro, la estimulación inducida por el MPA sobre células epiteliales tumorales HD. Todas estas observaciones nos llevaron a investigar qué papel cumple el REα, además del RP, en el crecimiento de estos tumores. Utilizamos la línea C4-HD como prototipo de tumor HD, y su variante C4-HI, capaz de crecer en ausencia de la administración de hormonas. Asimismo, teniendo en cuenta las líneas de trabajo llevadas a cabo en el laboratorio que sugerían que el estroma tumoral participaba en el crecimiento tumoral HI, quisimos investigar la participación de fibroblastos asociados a tumor (CAFs) en la activación de los RP, e investigar si los REα podrían estar también involucrados en la proliferación epitelial inducida por CAFs. Si bien en un principio pretendimos abarcar a los REß en este estudio, dada la complejidad de las interacciones observadas con el REalfa, decidimos abocarnos sólo a éste último. En cultivos primarios de células epiteliales o en tumores creciendo in vivo, observamos que el MPA induce la expresión, fosforilación y activación del REα en tumores HD, mientras que en los HI, éstos se encontrarían basalmente fosforilados y activos. La inhibición farmacológica o génica del REα indujo una inhibición de la proliferación celular de la misma manera que anteriormente se había observado al inhibir el RP. Esta inhibición fue lograda aún en presencia del RP. In vivo el antiestrógeno puro inhibió completamente el crecimiento tumoral inducido por MPA, mientras que indujo efectos inhibitorios en el tumor HI. Los resultados sugieren la necesidad de un REα presente y activado en forma ligando independiente en el crecimiento de ambas variantes tumorales. Demostramos además que la expresión del RP, si bien es modulable por estrógenos, no seria totalmente dependiente del REα. Por otra parte, detectamos interacción nuclear entre el REα y el RP en tumores creciendo in vivo, y en células epiteliales C4-HD in vitro, en un mecanismo regulado por el MPA. Estos resultados fueron corroborados usando anticuerpos que reconocen a los receptores fosforilados sugiriendo que los receptores estarían activos transcripcionalmente. Si bien ya estaba reportada la interacción citoplasmática entre el RPB y el REα, no hay datos aún que demuestren la interacción nuclear entre el RPA y el ERα. Teniendo en cuenta que el 17ß-estradiol (E2) y el ICI indujeron una disminución de la colocalización de ambos receptores sugerimos que dicha interacción es imprescindible para inducir el crecimiento tumoral. Quisimos evaluar si se trataba de una particularidad de nuestro modelo experimental y estudiamos la interacción de los mismos receptores en la línea de cáncer de mama humano T47D, en la cual pudimos observar que ambos receptores también interaccionan en el núcleo. La diferencia importante entre ambos modelos radica en el hecho que la línea T47D es estimulada por E2, además de progesterona, mientras que nuestros tumores son inhibidos por E2. En estudios previos hemos demostrado la participación de los CAFs, en el crecimiento tumoral HI. Vimos que el FGF-2 está más expresado en CAFs de tumores HI en cultivo, que en los CAFs HD y que es capaz de activar al RP. En este trabajo mostramos que los CAFs HI son más eficientes que los CAFs HD en estimular la activación del RP, y demostramos además que los antagonistas estrogénicos también inhiben la estimulación inducida por el FGF-2, mostrando nuevamente un paralelismo entre la estimulación inducida por MPA y la estimulación inducida por CAFs. Interesados por las diferencias observadas entre los CAFs HD y los CAFs HI en regular el crecimiento celular y activar los receptores hormonales, el siguiente objetivo planteado fue caracterizar de forma molecular, a través de microarrays de ADN, la participación del MPA en el crecimiento tumoral HD, como así también, obtener información sobre las diferencias entre el crecimiento tumoral HD y HI, y la participación del estroma y del epitelio en la adquisición del fenotipo HI. Los resultados mostraron que en ausencia del MPA, un mayor número de genes resultaron sobreexpresados en tumores C4-HD en comparación a la condición proliferativa con el progestágeno. Genes asociados con arresto del ciclo celular se vieron incrementados en el tumor sin MPA, mientras que curiosamente en el tumor creciendo en presencia del MPA, uno de los genes sobreexpresados fue el FGF-2. Pudimos establecer diferencias en los patrones de expresión génica entre tumores C4-HD y C4-HI; mientras que por estudios de Laser capture microdissection (LCM) acoplados a microarrays de ADN, confirmamos que tanto el parénquima como el estroma de tumores HI, son diferentes a los del tumor HD. Observamos alta expresión de metaloproteasas y genes relacionados a mecanismos de reparación de heridas y quimiotaxis, en el estroma C4-HI. Las evidencias sustentan la hipótesis de la participación del estroma en la adquisición del fenotipo HI, dado que cambios en el compartimiento estromal podrían causar cambios en las señales parácrinas que modifiquen el comportamiento del tumor, a través de mecanismos que involucren tanto la activacion del RP como del REα.

Nuestro laboratorio estudia la descondensación nuclear del espermatozoide humano in vitro, intentando ahondar en la comprensión de las etapas del proceso y las moléculas involucradas en el mismo. La descondensación requiere la reducción de puentes disulfuro en las protaminas y la remoción de las mismas para ser reemplazadas por histonas ovocitarias. Los espermatozoides humanos pueden descondensarse in vitro con heparina y glutatión. Observamos en estudios previos que el heparán sulfato (HS), análogo estructural de la heparina, pero no así otros glicosaminoglicanos, presenta actividad descondensante in vitro similar a la heparina y propusimos que HS actuaría in vivo como aceptor de protaminas. El presente trabajo tuvo como objetivos (1) acercarse a las condiciones in vivo analizando el comportamiento de núcleos aislados frente a la descondensación con heparina y glutatión in vitro y (2) demostrar que HS está presente en el ovocito y podría funcionar como agente descondensante. Se utilizaron espermatozoides de donantes normospérmicos (OMS) y ovocitos de ratón. Los núcleos espermáticos aislados descondensaron con glutatión y heparán sulfato o heparina pero no con otros glicosaminoglicanos. El análisis por microscopía confocal reveló localización de HS en el citoplasma y el espacio perivitelino del ovocito. La utilización de enzimas específicas indicó que la capacidad descondensante del ovocito podía atribuirse a la presencia de HS. Estas son las primeras evidencias de la presencia de HS en el ovocito y de su posible rol como aceptor de protaminas durante la descondensación del espermatozoide humano in vivo.

Fil:Estévez, Alvaro Germán. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Alteraciones en la proliferación y diferenciación de células trofoblásticas (TB) en sus diversos fenotipos funcionales, defectos en la transformación vascular y un control deficiente de la respuesta inflamatoria materna en etapas tempranas de la gestación se asocian con complicaciones gestacionales como la preeclampsia y la restricción del crecimiento intrauterino. Diversos factores solubles y de contacto participan en estos procesos durante la placentación. Proponemos la participación del péptido intestinal vasoactivo (VIP), ya que es sintetizado por TB y tiene actividad relajante muscular, vasodilatadora, e inmunomoduladora. El objetivo de esta tesis fue investigar la contribución del VIP y sus receptores VPAC en diversas funciones de TB, en particular en su capacidad de diferenciarse, migrar e invadir; su capacidad de interactuar con células inmunes deciduales favoreciendo la remodelación tisular en un microambiente anti-inflamatorio. Analizamos estos aspectos en diseños in vitro con líneas celulares trofoblásticas humanas de primer trimestre (Tb), la interacción de éstas con monocitos de voluntarios sanos o macrófagos derivados de ellos. En la segunda parte del trabajo evaluamos la expresión del VIP y los efectos del péptido en diseños ex vivo empleando explantos de placenta de primer trimestre obtenidas de abortos electivos en el marco de una colaboración con la Universidad de Manchester.Nuestros resultados demuestran que Tb tiene la capacidad de aumentar la migración de monocitos (Mo), que adquieran un perfil anti-inflamatorio con aumento en la producción de IL-10 y fagocitosis de cuerpos apoptóticos. Esos efectos fueron aún mayores si las Tb se incubaron previamente con VIP. Además, los medios condicionados de Tb tratadas con VIP disminuyeron la expresión de marcadores pro-inflamatorios, aumentaron los anti-inflamatorios y la fagocitosis de cuerpos apoptóticos en macrófagos (MA) diferenciados con GM-CSF.Cuando estudiamos placentas humanas de primer trimestre, detectamos que las TB extravellosas expresan VIP y este aumentó la migración por una vía dependiente de PKA. Cuando silenciamos el VIP en Tb, observamos una disminución en la expresión de genes de remodelación de la matriz extracelular, en especial las metaloproteasas (MMP) 2 y 9. Las TB VIP positivas se encontraron principalmente en la luz de las arterias espiraladas y glándulas maternas sugiriendo su función de remodelación. Además, VIP aumentó la secreción de IL-10 y varias quimioquinas y disminuyó la de G-CSF en TB. Cuando analizamos las células NK y MA deciduales en estas muestras de placenta detectamos que expresan VPAC1 y VPAC2 y que el VIP disminuyó la secreción de los marcadores pro-inflamatorios IL-1β, IL-8 e IL-12 y aumentó IL-10. Además, solo en los dMA el VIP aumentó la expresión y actividad de la MMP-2, consistente con un efecto sobre la transformación vascular.Estos resultados aportan evidencias acerca de la modulación por VIP de la función trofoblástica y su interacción con células inmunes en la interfase temprana y sugiere su papel como modulador endógeno a través de circuitos autocrinos y paracrinos. Las evidencias presentadas aquí sostienen un papel del VIP de origen trofoblástico durante la placentación. Su eventual potencial y validación como biomarcador requerirá abordajes en diseños clínicos de cohortes en pacientes con y sin complicaciones gestacionales.

La Apnea del Sueño (AS) es un grave problema para la Salud Pública que afecta a una notable proporción de la población. En animales de laboratorio la AS se modela a través de la exposición a hipoxia intermitente (HI) que induce alteraciones neuronales, gliosis reactiva, expresión del receptor RAGE y de su ligando S100B en el SNC. En esta tesis, desarrollamos un modelo de exposición a HI en cultivos primarios de hipocampo de roedores y ello nos ha permitido disecar algunas de las rutas de señalización que serían responsables de la neurodegeneración y la gliosis reactiva que se observa en modelos experimentales de AS. Así, demostramos que la exposición a HI induce stress oxidativo, activación de HIF-1 y NF-κB, un fenotipo reactivo en la astroglía y el acortamiento de las neuritas. Estas alteraciones, que correlacionan con los cambios observados en los animales expuestos al modelo de AS por HI, fueron prevenidos por la aplicación en el medio de cultivo de anticuerpos neutralizantes de RAGE así como por la sobreexpresión de un dominante negativo de RAGE entregado por un vector viral o el bloqueo farmacológico de NF-κB y Akt. La manipulación experimental de los niveles de S100B no fue tan efectiva para reducir estas alteraciones. Basándonos en estos resultados utilizamos el mismo enfoque para intentar disminuir las alteraciones neuro-gliales en el modelo experimental de AS por HI en roedores. Así, el bloqueo de RAGE con anticuerpos neutralizantes administrados intrahipocampalmente o la expresión del dominante negativo de RAGE entregado por un vector viral, tanto como el bloqueo farmacológico de NF-κB fueron efectivos para disminuir la gliosis reactiva y la neurodegeneración. Estos resultados indican que RAGE y NF-κB estarían involucrados en las alteraciones neuronales y la gliosis reactiva inducidas por la AS. Estas rutas de señalización serian así interesantes blancos moleculares para el desarrollo de estrategias de neuroprotección útiles en la AS.

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El tratamiento periodístico de los desastres naturales responde a los criterios que los medios establecen para esa cobertura específica, ello no presupone un análisis de los conceptos acerca de la naturaleza. Se ha observado que, más allá de la perspectiva de “noticiabilidad” que despliegan los medios de comunicación, las categorías ontológicas puestas en juego en los productos periodísticos no están siendo objeto de análisis por parte de quienes la enuncian. De allí que la investigación desarrollada en este documento se ocupara de indagar cómo se presenta la relación naturaleza-cultura en los diarios Clarín, La Nación y El Tribuno, y en la Radio Comunitaria La Voz Indígena al momento de informar sobre las inundaciones del río Pilcomayo (Provincia de Salta) que ocurrieron en el verano del año 2018. El objetivo de este estudio ha sido conocer las causas y las consecuencias de las inundaciones de acuerdo con la información que han brindado los diarios, versión digital, y la radio indígena. La tesis se inscribe en el marco de la emergencia climática por la que atraviesa el mundo, las singularidades que se desprenden del relato de los medios masivos, el tránsito por el “Antropoceno”, y la comunicación indígena estableciendo diferencias. Por ello, el contexto de interculturalidad de esta producción requiere considerar como variable de análisis las ontologías indígenas expresadas al momento de referir una inundación en los medios de comunicación. Metodológicamente se tomó como corpus de esta investigación las publicaciones de los tres diarios mencionados por un periodo de tres meses, y uno de los programas de la radio indígena durante un periodo similar. Luego, se profundizó en el estudio de las publicaciones utilizando la técnica del análisis de contenido, con la finalidad de generar dimensiones de análisis entre las cuales se incluyen las ontologías. Así pues, se tiene que este trabajo de investigación da continuidad a la tesis de maestría cuyo objeto de estudio fue la radio indígena, la Ley 26522 en Argentina (Ley de Servicios de Comunicación Audiovisual) y la comunicación con identidad, dado que también analiza las particularidades de la comunicación indígena con la singularidad de que este trabajo detalla el modo como se describe la convivencia con la naturaleza.

Resumen temporalmente no disponible. La presente obra no cuenta con resumen provisto por el autor.

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