Catálogo de publicaciones

En los últimos años se revalorizó la idea de que el estado de salud se logra cuando hay un equilibrio psico-neuro-inmuno-endocrino. Células de los sistemas nerviosos, endocrino e inmune pueden sintetizar neurotransmisores, hormonas y citoquinas, así como sus respectivos receptores. Entre los neurotransmisores, la catecolamina dopamina no solo tiene un importante rol a nivel del sistema nervioso central regulando la actividad locomotora, cognitiva y comportamental, sino que puede modular funciones de glándulas endócrinas centrales. Además, se lo ha considerado un neurotransmisor clave entre el sistema nervioso y el sistema inmune, así como un mediador producido y liberado por las propias células inmunes, que, junto con las catecolaminas adrenalina y noradrenalina, puede modular diferentes procesos inmunológicos. La piel constituye la primera barrera inmunológica contra agentes microbianos y químicos ambientales. En la piel, los queratinocitos, fibroblastos y células inmunes residentes como los macrófagos, son capaces de reconocer noxas o señales de daño internas y externas, a través de receptores de reconocimiento de patrones (ejemplo, TLRs) desencadenando vías de señalización que permiten promover una respuesta inmune a nivel cutáneo. Por otro lado, los disruptores endocrinos, como el Bisfenol A (BPA), son sustancias presentes en el medio ambiente capaces de alterar el equilibrio hormonal. Considerando que: 1) la piel se encuentra ricamente inervada por nervios simpáticos productores de catecolaminas; 2) que el denominado "sistema inmune de la piel" se compone de una compleja red de células inmunes y no inmunes, entre ellas los queratinocitos y los macrófagos; y 3) que el BPA puede entrar en contacto con la piel y ser absorbido por la misma, se propuso como objetivo de esta Tesis doctoral, en el marco de las interacciones bidireccionales entre los sistemas inmune y neuroendócrino, evaluar la influencia de agonistas dopaminérgicos sobre los mecanismos moleculares que llevan a la activación de células del sistema inmune cutáneo, como queratinocitos y macrófagos e investigar los efectos de un tóxico ambiental disruptor endócrino -BPA- sobre estas células y su interacción con la vía dopaminérgica. Los resultados obtenidos sugieren que, en queratinocitos humanos, los agonistas dopaminérgicos pueden estimular la producción de IL-6 e IL-8, efectos mediados por receptores dopaminérgicos, β-adrenérgicos y la intervención de mecanismos oxidativos independientes de receptores. El aumento observado sobre la producción de citoquinas se acompañó con la activación del factor de transcripción nuclear NFκB. Además, la dopamina disminuyó la migración de los queratinocitos concordante con la disminución en la actividad MMP-9, acciones que serían mediadas en parte por receptores β-adrenérgicos. Además, se demostró, en macrófagos humanos, que la dopamina estimuló la producción de IL-8, sin modificación de IL-1β, acción mediada parcialmente por receptores β-adrenérgicos, y la actividad de MMP-9, sin involucrar la activación del factor de transcripción NFκB. Resultados obtenidos con los medios condicionados de los macrófagos indicarían que el efecto estimulante de dopamina sobre la producción de IL-8 en los macrófagos THP-1 favorecería la migración de los queratinocitos, efecto que se vería inhibido en presencia de altos niveles de IL-6, sugiriendo un efecto modulador del neurotransmisor en la interacción entre ambas células en relación con el proceso de cicatrización. También, se estudió la participación de receptores de la inmunidad innata, TLR3, en la neuromodulación de la respuesta inmune cutánea, demostrando que la disminución en la producción de IL-8 por parte de dopamina, estaría relacionada con una menor actividad de MMP-9 y un retraso en la migración celular inducida por el ligando de TLR3 luego de producirse la herida en los queratinocitos. Por último, se demostró que el disruptor endocrino, a tiempos cortos, no modificó la producción de citoquinas ni la respuesta a dopamina en los queratinocitos HaCaT. Con una estimulación prolongada del BPA, no se observaron cambios en los niveles de IL-6 ni en la activación de NFκB inducidos por dopamina, pero si sobre la producción de IL-8 y la actividad de MMP-9, a diferencia de lo obtenido en ausencia del disruptor endocrino. En cuanto a los macrófagos humanos, se observó que el BPA, a tiempos cortos, no modificó los niveles de IL-8 ni la respuesta a dopamina. La estimulación prolongada de BPA sobre los macrófagos modificó los niveles de IL-8 a diferencia de lo observado en ausencia de BPA. Además, no se indujo la activación de la vía de NFκB en ausencia o presencia de dopamina, pero si favoreció la actividad de MMP-9. Estos resultados sugieren que el BPA, a tiempos cortos, solo o en combinación con dopamina no modificaría la producción de citoquinas en nuestros modelos de queratinocitos y macrófagos humanos. Por otro lado, pudimos inferir de los resultados obtenidos, que las células cultivadas con BPA por tiempos prolongados pueden afectar la respuesta a dopamina en queratinocitos y macrófagos humanos. En conjunto estos resultados, proponen que la dopamina es un neurotransmisor importante en las interacciones neuro-inmuno-endocrino a nivel de la piel, sugiriendo un rol que podría ser desfavorable en procesos fisiológicos como la cicatrización. Estos resultados, serían de interés desde el punto de vista de los tratamientos de enfermedades neurodegenerativas y/o dermatológicas, ya que existen fármacos utilizados en la clínica para tratar estos desórdenes que poseen acción neuroinmunoendocrina. Además, se estableció una interacción entre los disruptores endocrinos y las acciones dopaminérgicas a nivel de células del sistema inmune cutáneo, un área de estudio novedosa que podría ser útil para estudios inmunotoxicológicos.

Fil:Romeo, Horacio Eduardo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Las hormonas tiroideas (HTs) son importantes reguladoras de la respuesta inmune, pero su participación en el desarrollo tumoral es controversial. El objetivo de este trabajo fue estudiar la modulación de las HTs sobre el comportamiento biológico y evolución del linfoma T EL-4 creciendo in vivo en ratones singeneicos eu- (controles), hiper- (hiper) o hipotiroideos (hipo). El tratamiento de las células EL-4 in vitro con HTs indujo un aumento en la proliferación y cambios en los niveles de expresión de reguladores del ciclo celular a tiempos cortos, pero llevó a la apoptosis a tiempos más largos de cultivo. La inoculación de las células EL-4 en animales hiper desarrolló tumores sólidos de mayor volumen que el de los Controles, pero los hipo presentaron un mayor número de metástasis. Adicionalmente, los tumores hiper mostraron un aumento en los niveles de expresión de ciclinas, mientras que en los hipo encontramos niveles incrementados de p16, p27 y p53. Los tumores hiper también exhibieron mayor angiogénesis por inmunohistoquímica y una expresión aumentada de metaloproteasas, por qRT-PCR, junto con incrementada apoptosis. Por otra parte, los ratones hiper mostraron un menor infiltrado linfocitario tumoral, compuesto por un menor porcentaje de linfocitos CD8+ que los ratones control. Por otra parte, los bazos de estos animales presentaron una aumentada proporción y actividad de células NK, junto con un menor porcentaje de células supresoras de origen mieloide. Los ratones hipo, sin embargo, mostraron una reducción en la actividad citotóxica específica contra células tumorales. Nuestros resultados sugieren que el estado tiroideo es capaz de modular el crecimiento tumoral a través de mecanismos que involucran la regulación de proteínas relacionadas con la progresión y/o arresto del ciclo celular y de la angiogénesis, y a través del control de la respuesta inmune antitumoral que puede limitar su diseminación.

A lo largo de la evolución, los mamíferos han desarrollado una serie de respuestas fisiológicas que resultan en la contención el agente patógeno. La fuerte interconexión entre el sistema neuroendócrino y el sistema inmunológico, no sólo optimiza la respuesta defensiva, sino que también puede verse desregulado cuando el patógeno no puede eliminarse, y cuyo resultado suele ser el daño tisular. A nivel experimental, los resultados obtenidos en este trabajo indican que la respuesta inmune excesiva que tiene lugar durante la infección con T. cruzi en los animales C57BL/6 promueve un contexto endócrino-metabólico claramente desfavorable. Como resultado del desbalance inmuno- endócrino y metabólico, se observan importantes cambios catabólicos que resultan en una marcada reducción del peso corporal, una marcada hipoglicemia, un deterioro general del animal y en una letalidad del 100%. Por otra parte, la drástica pérdida de TA que se produce durante la infección está asociada con el fracaso de la respuesta inmune, ya que no se logra controlar el crecimiento parasitario. En este contexto, la disminución de la expresión en el TA de adiponectina y PPAR-γ, contribuiría a perpetuar el fenotipo inflamatorio y el daño tisular. El efecto de los agonistas PPAR-γ resultó poco efectivo durante la infección en términos de control de la respuesta inflamatoria a nivel tisular y sobre el curso de la infección. Nuestro estudio también indica que en la Enfermedad de Chagas crónica humana hay alteraciones en el eje HPA, lo cual resultaría en un control deficiente del componente inflamatorio y el daño tisular que afecta principalmente al miocardio. La naturaleza inflamatoria de la MCC y los datos que apuntan a un aumento en el IMC y el ICC, el índice HOMA-IR y en los niveles de insulina y glicemia de los pacientes chagásicos, hace difícil aseverar hasta qué punto los niveles de leptina (y otros mediadores metabólicos) se relacionarían con el desequilibrio energético o con el proceso inmune crónico que subyace a la infección. Si se puede afirmar que el sobrepeso y sus consecuencias inmuno-metabólicas son un factor importante a tener en cuenta a la hora de evaluar esta población ya que es una comorbilidad predominante en la población de Chagas urbanizado y podría influir en el agravamiento de la patología cardíaca.

Se ha postulado que la morfina inhibe la respuesta de escape a un estímulotímulotímulo visual de peligro en el cangrejo Chasmagnathus granulatus debido a una acción a nivel central, y que durante la habituación a dicho estímulo, se activaríaopiáceotema opiaceo endógeno que modularía negativamente la respuesta. La viabilidad de la hipótesis de la acción central moduladora fue analizada en una serie de experimentos, en 10s que se usó como indicador, además de la respuesta de escape, la respuesta optomotora, es decir, un comportamiento inducido por un estímulo que "no" señaliza peligro;y como droga inhibidora, además de la morfina, el aminoácido GABA,es decir, un inhibidor “periférico” de la actividad motora. Las mayores dosis de morfina con claro efecto inhibidor sobre la respuesta de escape no afectaron la respuesta optomotora, excluyendo si la posibilidad de explicar la acción de la droga sobre la primer respuesta, en términos de efecto detrimental sobre la aferencia visual o sobre la capacidad motora. Una dosis de 75 microg/g de morfina, administrada 30 min. antes de una sesión de entrenamiento habituante al estímulo de peligro, produjo un descenso paralelo de la curva de habituación, conforme con lo que debería esperarse si la droga tuviese una acción moduladora negativa sobre la respuesta. Dosis pre entrenamiento de 100 microg/g de morfina o de 9 microg/g de GABA, redujeron drásticamente la reactividad durante la sesión de habituación, pero mientras la administración de morfina impidió la adquisición de la habituación de largo término, la de GABA no afectó esa adquisición. Este resultado apoya la idea de que el efecto de la morfina se debe a una interferencia transitoria entre el estímulo y su significado innato de peligro. Para investigar el posible valor adaptativo de la gran propensión de Chasmagnathus a adquirir rápidamente una habituación por largo tiempo, así como el sistema opiáceo se estudió y se comparó su comportamiento con el de Pachygrapsus marmoratus, una especie filogenéticamente cercana pero ecológicamente distante. Los resultados indicaron que Chasmagnathus posee una capacidad mucho mayor para habituarse que Pachygrapsus, mostrando una habituación de corto término mas profunda, parcialmente mediada por una modulación opiácea endógena, y una habituación de largo término mas rápida y duradera, parcialmente mediada por la representación mnésica de las claves del contexto. Se estudió también la capacidad para adquirir una habituación de largo término en cangrejos de la misma especie pero de diferentes edades, demostrándose que los animales viejos exhiben una retención de la habituación claramente menor que los animales más jóvenes. El valor adaptativo de estas diferencias es discutido en consideración a las presiones ecológicas a las que se encuentra sometida cada especie, y a la correlación entre los cambios dependientes de la edad y un cambio ontogénico de hábitat y de actividad exploratoria.

El NO es una molécula altamente difusible y reactiva producida en el sistema nervioso que actúa como mensajero neuronal y participa en procesos fisiológicos y patológicos. El NO modula la actividad de numerosos receptores de neurotransmisores y canales iónicos. En particular, los GABAARs pueden ser modulados por agentes rédox y por NO, aunque los efectos y mecanismos de este último no están claros. En esta tesis, caracterizamos los efectos del NO sobre GABAρ1Rs expresados de forma heteróloga y estudiamos la actividad de los GABAARs fásicos y tónicos de células piramidales en rebanadas de hipocampo con distintos niveles de NO. Los receptores homoméricos GABAρ1 se expresaron en ovocitos de Xenopus laevis, y las respuestas evocadas por GABA se registraron electrofisiológicamente, en presencia y ausencia de donantes de NO. Las respuestas se potenciaron significativamente por el NO de forma rápida, reversible y dosis-dependiente. El bloqueo químico de las cisteínas mediante reactivos selectivos para sulfhidrilos previno la potenciación por NO, indicando que las cisteínas participan de la modulación. Cada subunidad ρ1 tiene solo tres cisteínas, las dos extracelulares que forman el cys-loop (C177 y C191) y una intracelular (C364). El reemplazo por alanina de la C364 no modificó los efectos del NO sobre el receptor, lo que sugiere que el NO potencia los GABAρ1Rs a través de una interacción con el cys-loop extracelular. Por otra parte, en rebanadas de hipocampo, se realizaron registros con la técnica de patch-clamp en configuración célula entera, y se estudiaron los efectos del NO sobre los GABAARs. Las corrientes fásicas se registraron aplicando puffs de GABA y, las corrientes tónicas se midieron analizando la IH antes y después de la aplicación de bicuculina (BIM). El nivel de NO se incrementó por la aplicación de donantes de NO y se disminuyó bloqueando la producción de la NOS. El incremento en los niveles de NO no modificó significativamente la actividad de los GABAARs. Sin embargo, el bloqueo de la síntesis de NO endógeno potenció la corriente GABAérgica tónica y la evocada por puffs de GABA. Estos resultados indican que los efectos del NO sobre los GABAARs son dependientes de la subunidad y sugieren que las acciones del NO en el hipocampo estarían en parte mediadas por la modulación de la actividad inhibitoria.

MODULACIÓN REDOX DE LOS RECEPTORES GABACρ1: En condiciones fisiológicas en el SNC la producción de especies reactivas de oxígeno es una consecuencia natural del metabolismo celular y el posible daño oxidativo se encuentra balanceado por antioxidantes intrínsecos. La actividad de un gran número de receptores sinápticos y canales iónicos puede ser modulada por agentes redox endógenos y/o farmacológicos. Estos incluyen a los NMDAR y AChR, así como también a los GABAAR, entre otros. Aunque, los GABAAR son susceptibles a diversos agentes redox, estudios previos sugerían una falta de sensibilidad de los GABACR a este tipo de modulación. Con el fin de estudiar si compuestos con propiedades redox son capaces de modular la actividad de los GABACR se expresaron heterólogamente en ovocitos de Xenopus laevis GABACR ρ1 homoméricos (GABAρ1R), y sus respuestas -corrientes de Cl- evocadas por GABA- se registraron electrofisiológicamente. Nuestros resultados muestran que los GABAρ1R, al igual que otros miembros de la familia cys-loop, son sensibles a los agentes redox. En presencia de compuestos reductores las curvas D-R se desplazaron hacia la izquierda, mientras que los oxidantes produjeron el efecto opuesto, esto indica un aumento o una disminución, respectivamente, en la afinidad aparente por el agonista de los GABAρ1R. Asimismo, encontramos que la modulación inducida por ácido ascórbico, un antioxidante celular, presenta tanto componentes redox como alostèricos. La modulación de los GABAρ1R fue suceptible a la modificación química de los grupos sulfhidrilos y a la mutación H141D, indicando que estos sitios, localizados en el dominio extracelular, tienen un importante rol en el proceso.

El rol neuromodulador de la serotonina ha sido conservado a lo largo de la evolución y se ha observado en invertebrados y en vertebrados. Los invertebrados han sido utilizados como modelos de estudio de la modulación por serotonina, ya que la simpleza de sus sistemas nerviosos, permite correlacionar alteraciones comportamentales con modificaciones en los circuitos neuronales subyacentes a dichos comportamientos. La posibilidad de identificar inequívocamente a las neuronas serotoninérgicas, permite correlacionar su actividad con los efectos atribuidos a la serotonina. La serotonina es un importante neuromodulador en la sanguijuela: interviene en la modulación de varios comportamientos tales como la alimentación, el acortamiento defensivo y la natación. Las neuronas serotoninérgicas Retzius constituyen su fuente principal de liberación. La estimulación mecánica de la piel del animal produce la activación de las células mecanosensoriales P. Dicha activación es suficiente para evocar diversas respuestas motoras y a su vez, en paralelo, activar a las neuronas Retzius. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo el estudio de la modulación serotoninérgica de un circuito sensoro-motor en el sistema nervioso central de la sanguijuela Hirudo medicinalis, basándose en la hipótesis de que la salida motora final estará determinada por la interacción de la via sensoromotora y la vía sensoro-moduladora. En la primera parte del trabajo se caracterizó la vía sensoro-motora entre las neuronas mecanosensoriales sensibles a presión (P) y las motoneuronas annulus erectus (AE), que inervan los músculos responsables de las erección de los ánulos en que se divide la pared corporal del animal. Losresultados muestran que: - La motoneurona AE recibe dos señales simultáneas ante la activación de la neurona mecanosensorial P: una excitatoria y otra inhibitoria. La fase excitatoria está mediada por una sinápsis directa y la inhibitoria por una interacción polisináptica. - La interneurona pasiva 151 ejerce un rol modulador sobre la sinápsis P-AE, interactuando con la motoneurona AE y con la(s) interneurona(s) que media(n) la fase inhibitoria de la conexión P-AE. En la segunda parte del trabajo se analizó el efecto de la serotonina exógena y de antagonistas serotoninérgicos sobre las propiedades intrínsecas de las neuronas P y AEy sobre la interacción P-AE. - La aplicación de serotonina exógena produjo la hiperpolarización de las neuronas AE, por activación de una conductancia a cloro sensible a los antagonistas metiotepina y mianserina. - La serotonina exógena causó una disminución de la amplitud de la fase inhibitoria de la interacción P-AE,y los antagonistas metiotepina y mianserina bloquearon este efecto. - La serotonina endógena ejercería una inhibición sobre la interacción P-AE.

Esta Tesis está dedicada al desarrollo de un modulador de ancho de pulso (PWM) para el control de inversores de potencia trifásicos. Los moduladores de PWM se utilizan ampliamente en la industria, para el control de motores y otras aplicaciones trifásicas, en donde la amplitud y frecuencia deben ser controladas. La elección e implementación de un método de PWM afecta la eficiencia del Inversor de potencia y la calidad de la forma de onda de la tensión de salida. En ese trabajo se pone especial énfasis en la modulación del vector espacial y su implementación con dispositivos de lógica programable, de modo de lograr una implementación independiente del control de la aplicación y con suficiente flexibilidad como para ser utilizado por distintas aplicaciones. El modulador vectorial universal propuesto en esta Tesis es capaz de trabajar con transición continua, desde una amplitud nula en la zona lineal de modulación hasta la onda cuadrada con pleno aprovechamiento de la tensión continua disponible. En él se realiza una compensación del tiempo muerto de excitación de las columnas, sin utilizar sensores de corriente. El modulador recibe las señales de referencia a través del bus ISA de una PC y genera como salidas las señales de excitación de los interruptores del inversor. El análisis desarrollado se complementa con resultados de simulación en lo referente a la implementación digital, y con resultados experimentales sobre un inversor de pequeña potencia.

Los pelos radicales son importantes para la absorción de nutrientes y agua del suelo y sirven de anclaje a la planta. Estos poseen un crecimiento polarizado, es decir que crecen en un solo sentido. Este tipo de crecimiento se caracteriza por tener un comportamiento oscilatorio, acompañado por un gradiente de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de iones Ca2+. Las paredes celulares en las plantas imponen límites al crecimiento. Por lo cual, debe sufrir modificaciones constantes para lograr la expansión. Las paredes celulares están compuestas por polisacáridos y proteínas ricas en hidroxiprolina (hydroxyproline-rich glycoproteins; HRPGs) que incluyen a las extensinas (EXTs). Estas últimas, están unidas covalentemente a través de sus residuos de tirosinas, formando una red. Las Peroxidasas apoplásticas (PERIII) son enzimas que llevan a cabo tres diferentes ciclos enzimáticos, llamados ciclo peroxidativo, ciclo hidroxílico y ciclo oxidativo. Durante su ciclo peroxidativo, las PERIII usan H2O2 como agente oxidante para producir radicales libres en componentes fenólicos y glicoproteínas estructurales que pueden, en forma subsecuente forman enlaces covalentes estables. Esta actividad contribuye a la rigidización de la pared celular y por lo tanto limita el crecimiento. Las PERIII pueden también causar la relajación de la pared celular mediante su ciclo hidroxílico, en el cual producen ROS, lo que provoca el clivaje de polisacáridos en forma no enzimática y un relajamiento general de la pared celular. Por lo tanto, las PERIII pueden cumplir roles opuestos en la expansión celular, dependiendo de las condiciones de crecimiento. Finalmente, en el ciclo oxidativo las PERIII generan radicales super-óxido (O2•-) a partir de la reducción de 1O2, que puede ser dismutado a H2O2, ya sea espontaneamoente o enzimaticamente mediante la superóxido dismutasa (SOD) modulando así, los niveles de ROS. En esta tesis, se identificaron a las PERIII involucradas en el crecimiento del pelo radical. Se determinó su función en la producción de ROS necesario para la expansión y los efectos que estas enzimas producen en la pared celular. También, se demostró que las PERIII están reguladas por el FT RSL4, el cual es activado por auxinas a través de ciertos factores de respuesta a auxinas (ARFs). Los ARFs implicados en este proceso también fueron identificados en este trabajo. Otras enzimas que podrían modificar la estructura de la pared celular son las Las Cisteína-Endo Peptidasas (CEPs). Éstas son capaces de clivar EXTs a nivel de prolina e hidroxiprolina glicosilada, razón por la cuál, se hipotetiza que podrían regular ya sea el desensamblado de la red de EXTs en el apoplasto y/o ejercer un control de calidad en aquellas EXTs mal procesadas (sub-glicosiladas o sobre-glicosiladas) en el sistema secretorio en el RE-Golgi. En esta tesis se determinaron cúales son las CEPs que se expresan en pelos radicales, se exploró el rol biológico de estas enzimas y su regulación transcripcional durante la expansión polarizada del pelo radical.