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Los Bifenilos Policlorados (PCBs) son compuestos organoclorados, recalcitrantes y tóxicos que comenzaron a sintetizarse en 1929 para emplearse como aislantes y refrigerantes en transformadores eléctricos. Los hongos de pudrición blanca mediante sus enzimas ligninolíticas, tienen potencial para remover estos compuestos.El objetivo general de este trabajo fue evaluar el potencial de remoción de PCBs de hongos de pudrición blanca nativos de la provincia de Misiones para su posterior uso en estrategias de biorremediación.Veintiséis cepas de hongos causantes de pudrición blanca fueron evaluadas y presentaron diferentes niveles de tolerancia y actividad enzimática ligninolítica. La correlación entre la actividad lacasa y la tolerancia, permitió el desarrollo de una ecuación que predice latolerancia en función de esta actividad, constituyendo una herramienta de selección fúngica.Irpex lacteus BAFC 1171, Pycnoporus sanguineus LBM 105 y Lentinus sajor-caju LBM 105 fueron capaces de crecer en medio líquido contaminado con 217 mg L-1 de PCBs tanto en un medio natural (Extracto de Malta con Extracto soluble de Maíz: MEM) como en un medio sintético con glucosa y asparagina como fuentes de carbono y nitrógeno respectivamente (GA). L. sajor-caju LBM 105 fue capaz de remover PCBs en los medios MEM y GA a partir de los 7 y 14 días de cultivo respectivamente, alcanzando un 95% remoción en el medio MEM y 92% en GA a los 35 días, reduciendo su toxicidad. P. sanguineus LBM 023 removió 42% en medio MEM y 69% en medio GA e I. lacteus BAFC 1171 removió 68% en medio GA al día 35 de cultivo. P. sanguineus LBM 023 presentó remoción selectiva por los congéneres con mayor grado de cloración en medio de cultivo MEM.La adición de PCBs modificó el aspecto macroscópico de las colonias y también produjo un incremento significativo en el diámetro de las hifas en las tres cepas evaluadas. La adición del contaminante, incrementó 4,8 veces los títulos producidos de lacasa por P. sanguineus LBM 023 en medio MEM y 40 veces en el medio de cultivo GA. La remoción dePCBs se correlacionó con los días de cultivo y, en menor medida, con la actividad lacasa en los sobrenadantes tratados con L. sajor-caju LBM 105. Se verificó la producción moderada de bioemulsionantes por I. lacteus BAFC 1171 y P. sanguineus LBM 023.La bioestimulación de suelo contaminado con PCBs se realizó mediante la adición de bagazo de caña de azúcar. Para el tratamiento de bioaumentación se utilizaron monocultivos y co-cultivos de P. sanguineus LBM 023 y L. sajor-caju LBM 105 inmovilizados en bagazo de caña de azúcar. Ambas cepas fueron capaces de desarrollarse en el suelo durante los 90 días evaluados. La actividad enzimática oxidativa e hidrolítica fue significativamente mayor en el co-cultivo respecto a los monocultivos al día 60. El perfil de secreción enzimática lacasa presentó un mayor número de isoenzimas con pesos moleculares de entre 37 y 56 kDa al día 60 en el tratamiento con el co-cultivo. Los tratamientos de bioaumentación con co-cultivo y bioestimulación redujeron significativamente la toxicidad del suelo contaminado y mejoraron la calidad del suelo tratado. Todos los tratamientos empleados removieron alrededor del 90% de los PCBs. La eficiencia de remoción decreció al incrementarse el grado de cloración. El tratamiento de bioestimulación con bagazo de caña de azúcar se presenta como una alternativa económica y práctica de remediación de suelo contaminado con PCBs mientras que, L. sajorcaju LBM 105 podría utilizarse efectivamente para remediar medios líquidos contaminados conaltas concentraciones de PCBs.

Debido al incremento de las actividades minera y metalúrgica de los últimos tiempos, las industrias producen efluentes con altas concentraciones de metales y sulfatos, entre los que se incluyen los lixiviados de minerales, los desechos metalúrgicos y los drenajes ácidos de minas (DAM). Estos últimos, de gran impacto ambiental y socio-económico, se caracterizan por tener bajos valores de pH generalmente entre 2 y 3, y en algunos casos aun menores. Debido a esta última condición, la solubilidad de los metales pesados se incrementa presentándose en elevadas concentraciones junto con sulfatos, entre otros iones. Existen numerosas metodologías que se utilizan para el tratamiento de estos efluentes ácidos. El más utilizado consiste en el agregado de agentes neutralizantes que producen la precipitación de los metales como hidróxidos y el aumento del pH del efluente; pero tienen la desventaja de producir grandes cantidades de sedimentos de difícil disposición final, entre otras. La bioprecipitación es una metodología alternativa con posibilidades de usarse en la remediación de estos efluentes así como en otros casos de contaminaciones producidas por metales pesados. En la bioprecipitación se utilizan microorganismos capaces de generar metabolitos que precipitan con muchos de los metales pesados. Dentro de estos microorganismos, se destacan fundamentalmente los microorganismos sulfato-reductores (llamados genéricamente BSR porque la mayoría son bacterias) que bajo condiciones de anaerobiosis, son capaces de reducir el sulfato a sulfuro, utilizando compuestos orgánicos sencillos como dadores de electrones. La generación de sulfuro biogénico y de alcalinidad, son las claves para su aplicación en la precipitación de metales como los sulfuros metálicos correspondientes. La principal ventaja de este tratamiento biológico, es la reducción del volumen de los sedimentos que se generan respecto de aquellos cuando se utilizan hidróxidos y carbonatos. Además, bajo condiciones de anaerobiosis, los sulfuros metálicos son más insolubles que los hidróxidos o carbonatos correspondientes, reduciendo la biodisponibilidad de los metales pesados. Uno de los grandes inconvenientes para la aplicación de este proceso es la gran sensibilidad de estos microorganismos a la acidez del medio, lo cual es frecuente en muchos efluentes industriales contaminados con metales pesados. Por esa razón, resulta relevante la búsqueda de nuevas especies y/o cepas, capaces de resistir bajos valores de pH y de todos modos ser eficaces en la precipitación de metales pesados. En los últimos tiempos se ha incrementado la búsqueda de microorganismos que habitan ambientes extremos debido a su potencial aplicación en procesos biotecnológicos como el mencionado anteriormente. Los ambientes volcánicos, como la zona geotermal de Caviahue-Copahue, suelen reunir estas condiciones y resultan ideales para el relevamiento y el aislamiento de comunidades sulfato-reductoras.

La co-contaminación ambiental es uno de los grandes problemas que enfrenta actualmente la humanidad a causa del avance tecnológico y el crecimiento poblacional. Particularmente, se ha detectado co-contaminación con Cr(VI) y lindano alrededor del mundo. En este sentido, la biorremediación empleando actinobacterias demostró ser una alternativa promisoria para la depuración de estos sitios. Además, el uso de consorcios microbianos resulta prometedor al incrementar las rutas metabólicas de remoción. Sin embargo, la biorremediación depende de diversos factores y sus interacciones, por lo que podría incrementarse la efectividad del proceso mediante la optimización de los parámetros intervinientes. Otro de los aspectos importantes del proceso es la verificación de la efectividad del método aplicado, la cual podría lograrse mediante la monitorización analítica y biológica de la biorremediación.En base a lo expuesto, se planteó como objetivo del presente trabajo de Tesis Doctoral optimizar la biorremediación de suelos contaminados con Cr(VI) y lindano utilizando actinobacterias. Inicialmente, se evaluó la remoción de Cr(VI) y lindano en medio de cultivo líquido y en suelo no estéril (SNE), utilizando cultivos simples y mixtos de las actinobacterias Streptomyces sp. M7, MC1, A5 y Amycolatopsis tucumanensis AB0. En medio líquido, el cultivo simple de Streptomyces sp. MC1 y el consorcio cuádruple obtuvieron la mayor remoción de ambos contaminantes, mientras que en SNE, el cultivo simple de Streptomyces sp. M7 y el consorcio cuádruple lograron los mejores perfiles de remoción de Cr(VI) y lindano. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en SNE (matriz con la cual se continuó el estudio), se seleccionó el cultivo simple de Streptomyces sp. M7 y el consorcio cuádruple para determinar las condiciones óptimas de biorremediación. Luego de determinar las concentraciones óptimas de inóculo de Streptomyces sp. M7 y del consorcio cuádruple (1 y 2 g kg-1, respectivamente), se estudió la influencia de las concentraciones iniciales de los contaminantes, la temperatura y la humedad. Para ello, se utilizó un diseño factorial completo 24. Debido a que la actividad del consorcio cuádruple durante el proceso fue más predecible y presentó mayor homogeneidad de respuesta, éste fue seleccionado para los estudios posteriores. Además, se comprobó la sobrevida de las actinobacterias del consorcio cuádruple al finalizar el ensayo de biorremediación, empleando estudios bioquímicos y moleculares. Mediante un optimizador de respuesta se determinaron las condiciones óptimas de temperatura y humedad para la biorremediación dependiendo de las concentraciones iniciales de los contaminantes. Éstas fueron empleadas para tratar siete muestras reales de suelos del NOA contaminadas con Cr(VI) y/o lindano, de las cuales el consorcio cuádruple logró biorremediar eficientemente seis. Finalmente, se realizaron bioensayos ecotoxicológicos sobre cuatro especies vegetales (Raphanus sativus, Lactuca sativa, Lycopersicon esculentum y Zea mays) y una animal (Eisenia fetida). En base a la sensibilidad de las especies y sus bioindicadores frente a ambos tóxicos, Lycopersicon esculentum y Eisenia fetida fueron las especies seleccionadas para evaluar la efectividad de la biorremediación. De esta manera se confirmó el éxito de la biorremediación llevada a cabo por el consorcio cuádruple mediante la reversión de los efectos adversos causados por los contaminantes.

Objetivo general Aportar nuevos conocimientos que contribuyan al desarrollo y la optimización de estrategias de biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos, tanto en áreas de clima frío extremo (Antártida) como templado (La Plata). Objetivos específicos - Estudiar a escala laboratorio y en ensayos “on site”, tanto en suelos provenientes de áreas de clima frío extremo (Antártida) como de áreas de clima templado (La Plata), el efecto de la utilización de diferentes fuentes de macronutrientes (N y P). - Estudiar el efecto que tiene la mezcla de dos tierras de zona templada, con diferente concentración de hidrocarburos, sobre la estructura de las respectivas comunidades bacterianas y sobre la eficiencia de eliminación de hidrocarburos. Analizar el efecto de la bioestimulación con distintos nutrientes.

El limitado conocimiento sobre la diversidad, dinámica y funcionalidad de las comunidades microbianas durante los procesos de biorremediación hace difícil clarificar la contribución biológica a la efectividad del proceso, considerando que los microorganismos son los mayores responsables de un proceso que sin dudas resulta útil para el manejo de problemas de contaminación. En particular en las estrategias de bioaumento, la supervivencia de los microorganismos inoculados se encuentra íntimamente relacionada con la competencia por los recursos con la población microbiana nativa del sitio contaminado; por lo tanto resulta crítico no solo entender la fisiología del inóculo sino también como afecta la estructura y la función de la comunidad microbiana del suelo a la cual se está introduciendo. Con el objetivo de contribuir al mejoramiento de los conocimientos básicos relacionados con la ecología microbiana y la efectividad de estrategias de bioaumento, aplicadas a la biorremediación de suelos contaminados con PAH, se orientó el trabajo de tesis, en primer lugar, a obtener y caracterizar un consorcio bacteriano degradador de fenantreno para ser utilizado en estrategias de bioaumento y aplicar estrategias “ómicas” para estudiar su dinámica funcional durante la degradación de fenantreno en medio líquido. El consorcio, (CON) obtenido de un suelo crónicamente contaminado con PAH, presentó la capacidad de degradar el 59% del fenantreno suplementado a los 7 días de incubación. La composición de CON se estudió por métodos dependientes e independientes de cultivo. Por métodos dependientes de cultivo, se lograron aislar cinco cepas bacterianas y se estudió la degradación del hidrocarburo tanto en cultivos puros de las mismas, encontrándose que solo la cepa AM (afiliada al género Sphingobium sp.) mostró la capacidad de degradar fenantreno, como en consorcios definidos (cultivos mixtos), encontrando una mayor eficiencia de degradación que el consorcio natural y que la cepa AM. De los métodos independientes de cultivo utilizados, la pirosecuenciación del gen 16S rRNA nos permitió conocer la composición de CON en términos de abundancia relativa de cada uno de los miembros. La caracterización catabólica de CON se llevó a cabo con un enfoque metagenómico y metaproteómico. Mediante la construcción de una biblioteca metagenómica a través de un screening funcional se encontraron clones con secuencias de genes codificantes de enzimas de la ruta de degradación de compuestos aromáticos que se afiliaron al orden Burkholderiales, revelando la presencia de al menos otra cepa con capacidad de degradar PAH en CON. Analizando el metaproteoma del consorcio mediante electroforesis bidimensional se identificaron proteínas pertenecientes a dos órdenes presentes en CON, Sphingomonadales y Burkholderiales, confirmando que se encontraron metabólicamente activos durante la degradación de fenantreno. En segundo lugar se estudió el impacto de la inoculación con diferentes formulaciones bacterianas sobre la estructura y dinámica de comunidades bacterianas de un suelo prístino contaminado con fenantreno y de un suelo crónicamente contaminado con PAH (proveniente de un proceso de Landfarming de un residuo petroquímico) mediante pirosecuenciación del gen 16S rRNA, a partir del DNA total de cada suelo. Además se correlacionaron los cambios en la estructura y dinámica de las comunidades bacterianas con la efectividad del proceso de biorremediación. Para ello se llevaron a cabo ensayos en microcosmos de los suelos mencionados y se inocularon diferentes formulaciones, entre las que se encontraron el consorcio natural (CON) y la cepa degradadora AM. En el suelo recientemente contaminado se podría afirmar que la estrategia de bioaumento llevada a cabo con el consorcio natural y la cepa degradadora Sphingobium sp. AM no solo mejoró la degradación del contaminante, reduciendo el tiempo de adaptación de la comunidad microbiana, sino que además generó un impacto positivo sobre la diversidad del sistema. Sin embargo, en un suelo crónicamente contaminado, las estrategias de inoculación lograron aumentar la diversidad de la comunidad bacteriana de un suelo crónicamente contaminado con hidrocarburos, sin incrementar la degradación de los contaminantes, donde la comunidad nativa ya habría sufrido la presión de selección ejercida por la contaminación y se encontró adaptada a la presencia de hidrocarburos.

El bioetanol es el principal biocombustible producido en Argentina. En Tucumán, la totalidad de este producto se elabora a partir de caña de azúcar con la finalidad de dar cumplimiento a lo establecido por la Ley Nacional de Biocombustibles, que estipula cortar las naftas de consumo interno actualmente con un 10 a 12% de bioetanol.La vinaza es el principal subproducto resultante de la obtención de bioetanol. Es un efluente de color marrón oscuro, fuerte olor y pH ácido, que presenta una demanda biológica de oxígeno (DBO) entre 35.000 y 60.000 mg O2 L-1, una demanda química de oxígeno (DQO) entre 70.000 y 150.000 mg O2 L-1 y un contenido elevado de sales minerales. Actualmente, en Tucumán la vinaza se dispone en lagunas de evaporación natural, terrenos de sacrificio y eventualmente en los cuerpos de agua. Esta última alternativa puede causar el bloqueo de los procesos fotosintéticos, produciendo un gran daño en el medio ambiente.Existen procesos físicos/químicos utilizados en el tratamiento de vinaza que usualmente son costosos y generan grandes cantidades de lodos y polución secundaria. La biorremediación es un método alternativo que resulta beneficioso para el medio ambiente. Esta involucra procesos de trasformación y/o adsorción de contaminantes, dependiendo del organismo. Los hongos son un grupo de microorganismos con un potencial intrínseco único para ser empleados en tratamientos de efluentes. Su capacidad para degradar contaminantes industriales se encuentra vinculada a la actividad de enzimas ligninolíticas que por su baja especificidad de sustrato pueden degradar los compuestos coloreados de las vinazas, resistentes en gran medida a la degradación microbiana. El objetivo general de esta tesis doctoral fue estudiar aspectos básicos de los procesos de decoloración y abatimiento de la carga orgánica de vinaza por microorganismos seleccionados.En este trabajo se aislaron diez basidiomicetes de distintos ecosistemas de la provincia de Tucumán. En base a su habilidad para decolorar vinaza y sintetizar enzimas ligninolíticas en medio sólido se seleccionaron dos de ellos. Los mismos se identificaron como Pycnoporus sp. P6 y Trametes sp. T3; en medio líquido fueron capaces de decolorar y remover compuestos fenólicos de una solución de vinaza al 10% (v/v). La inmovilización de ambos basidiomicetes en diferentes soportes permitió el tratamiento de vinaza cinco veces más concentrada, con mejores resultados de remoción del color y de fenoles que los respectivos cultivos de células libres. Se demostró que los hongos inmovilizados en bagazo de caña de azúcar y en espuma de poliuretano, pueden ser reutilizados para el tratamiento de un nuevo lote de vinaza al 50%, obteniendo porcentajes de remoción similares o superiores a los determinados en los ciclos iniciales. En todos los casos, la disminución de la DQO y la DBO así como los resultados de biotoxicidad, confirmaron la eficacia de los tratamientos realizados.Durante los tratamientos de vinaza se detectaron diferentes actividades enzimáticas ligninolíticas, posiblemente involucradas en el proceso. La actividad lacasa alcanzó títulos superiores a 2.500 UL-1, lo que plantea la posibilidad de utilizar estos hongos para la producción de lacasas para fines biotecnológicos.