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Fil:Perotti, Christian Pablo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En las últimas décadas, el promedio en la esperanza de vida de la población mundial ha aumentado debido a la mejora en la atención médica y las condiciones sociales y culturales. Este hecho viene de la mano con el consecuente deterioro motor y cognitivo, así como a un aumento en la incidencia de patologías relacionadas al envejecimiento, como es la Enfermedad de Parkinson. Durante el envejecimiento se observa una pérdida de la homeostasis cerebral y una neuroinflamación crónica, causada principalmente por microglia senescente. Estas células se encuentran polarizadas hacia un fenotipo proinflamatorio y generan una respuesta inmune exacerbada. De hecho, ha sido reportado que la progresión de muchas enfermedades neurodegenerativas depende de la activación de la microglia. Por tanto, es de gran interés diseñar estrategias que permitan modular el fenotipo de estas células gliales. Muchos factores neurotróficos producidos por las células gliales, como el IGF1, pueden polarizarlas hacia un fenotipo neuroprotector M2, promoviendo la supervivencia neuronal. Nuestro grupo de investigación ha fijado como objetivo de estudio combatir los efectos deletéreos del envejecimiento en ratas seniles mediante la implementación de la terapia génica con IGF1. En el presente trabajo de Tesis Doctoral hemos evaluado el efecto de esta terapia sobre la microglia en regiones del cerebro relacionadas con el desempeño motor, y su relación con la mejora en la performance motora debida a la terapia, anteriormente observada. Demostramos que la terapia génica con IGF1 aumenta el número de células microgliales con especificidad en el Núcleo Estriado de ratas seniles. Además, estas células presentan una mayor reactividad y se encuentran polarizadas hacia un fenotipo anti-inflamatorio M2. Observamos también que la microglia del Núcleo Estriado en ratas seniles tratadas con RAd-IGF1 presentan una mayor actividad fagocítica y mayor remodelación sináptica. A su vez, la terapia génica provocó una disminución en la expresión de genes pro-inflamatorios. Postulamos que estos cambios debidos a la sobreexpresión de IGF1, establecen un microambiente propicio para el correcto funcionamiento de las neuronas implicadas en el control motor generando una mejora de la conducta motora.

La timulina es una hormona producida exclusivamente por las células epiteliales tímicas; consiste en un nonapéptido biológicamente inactivo (facteur thymique sérique o FTS) coordinado al ión Zn⁺² en una relación equimolecular 1:1, lo cual le confiere su actividad biológica característica. La timulina participa en la diferenciación de los linfocitos T y en la modulación de varias de sus funciones. Los niveles circulantes de esta hormona se encuentran disminuidos durante el envejecimiento normal y en patologías tales como el SIDA y el síndrome de DiGeorge, una enfermedad caracterizada por la ausencia congénita del timo y de las glándulas parótidas. La secreción de timulina está influenciada por una compleja trama endocrina que incluye a la mayoría de las hormonas adenohipofisarias y periféricas. Recíprocamente, existe evidencia de que además de su acción inmunomoduladora, la timulina posee actividad hipofisotrófica in vitro y, por lo tanto, puede actuar directamente sobre la adenohipófisis in vivo, modulando la respuesta de la glándula a secretagogos o inhibidores hipotalámicos. En los últimos años, un número creciente de estudios coloca a la timulina como un mediador fisiológico (el primero descripto) del eje timo-cerebro-hipófisis. Además, existe evidencia de que la timulina estimula la liberación de citoquinas de ciertos tipos de linfocitos y de que posee actividad antiinflamatoria y analgésica en el sistema nervioso central y en modelos de inducción de la inflamación, a nivel periférico y local. La actividad endocrina y antiinflamatoria de este metalopéptido ha generado un creciente interés en la posibilidad de implementar estrategias de terapia génica para timulina en situaciones de disfunción tímica o en patologías cerebrales asociadas a procesos inflamatorios. Desafortunadamente, hasta el momento no se ha logrado clonar el gen de la timulina. Esta situación nos condujo a diseñar una secuencia sintética de ADN codificante para un análogo biológicamente activo de timulina, metFTS, la cual fue clonada en vectores de expresión apropiados, a fin de caracterizar las propiedades biológicas de dicho análogo tanto in vitro como in vivo. Una vez demostrada la funcionalidad del gen sintético diseñado, se construyó un vector adenoviral recombinante (RAd-FTS) portador de dicho gen sintético para implementar estrategias de terapia génica in vivo en modelos animales de timodeficiencia. Uno de estos modelos, el ratón congénitamente atímico (nude), exhibe ciertas deficiencias reproductivas que parecen estar directamente vinculadas a su carencia de hormonas tímicas circulantes. En efecto, pocos días después del nacimiento, tanto el ratón nude como el ratón normal neonatalmente timectomizado, desarrollan, además de un severo cuadro de inmunodeficiencia, una serie de alteraciones degenerativas en las glándulas tiroides, adrenales y expresan severas deficiencias en su función reproductiva. El vector adenoviral RAd-FTS logró una restauración prolongada de los niveles de timulina circulante cuando fue inyectado intramuscularmente en ratas y ratones adultos timectomizados. Asimismo, la terapia génica neonatal para timulina en la hembra nude, logró restaurar los niveles de timulina sérica y prevenir las alteraciones a nivel hipotalámo-gonadotropo-ovárico que típicamente ocurren en estos mutantes en la adultez. Consecuentemente, estos resultados señalan a la timulina como el mediador fisiológico, o al menos uno de los mediadores, de la influencia perinatal del timo sobre la maduración del eje hipotálamo-hipófisogonadal. Dicha influencia podría ejercerse a través del sistema neuroendocrino y/o directamente a nivel ovárico. Nuestros resultados se suman a la evidencia de que la timulina juega un rol fisiológico relevante como mediadora de la influencia perinatal del timo sobre la maduración del eje reproductivo y sugieren que terapia génica con el gen sintético para la timulina puede constituir una estrategia terapéutica efectiva para el abordaje de déficits reproductivos asociados con disfunciones endocrinas del timo.

En humanos y ratas, el envejecimiento está asociado a un progresivo deterioro del aprendizaje y la memoria espacial. Además, el envejecimiento trae aparejado cambios morfométricos en el hipocampo, una estructura clave en la formación y consolidación de la memoria. Uno de estos cambios es una reducción dramática de la neurogénesis en la región del Giro Dentado. La rata senil presenta cambios similares al humano en la morfometría de su hipocampo y, además, tiene un desempeño inferior al de la rata joven en pruebas de memoria espacial; por lo tanto, es un excelente modelo de investigación básica para desarrollar terapias novedosas contra el deterioro cognitivo asociado al envejecimiento. Previamente en nuestro laboratorio se puso a punto la metodología del estudio de la memoria espacial en ratas mediante el Laberinto de Barnes. En este trabajo de tesis estudiamos en mayor profundidad el impacto que tienen protocolos de variada intensidad sobre la habituación comportamental en nuestra colonia de ratas y descubrimos que la memoria espacial puede ser evaluada hasta un máximo de tres veces, tiempo después del cual los sujetos se habitúan a la tarea. Además, luego de poner a punto la tinción de Golgi, descubrimos que el mero hecho de estar expuestas al test cognitivo por tres meses indujo en las ratas un incremento en la densidad de espinas dendríticas de neuronas del hipocampo. Habiendo sentado las bases para el protocolo del Laberinto de Barnes para la evaluación de la memoria espacial en nuestra colonia de ratas, nos dispusimos a estudiar las diferencias comportamentales entre ratas jóvenes y seniles. Encontramos que las ratas seniles presentan un desempeño muy pobre en comparación con las jóvenes en el paradigma del Laberinto de Barnes. Luego nos preguntamos si este deterioro cognitivo tendría su correlato a nivel morfométrico y molecular en el hipocampo. En este sentido encontramos que el hipocampo senil presenta una dramática reducción en la tasa de neurogénesis, evaluada por inmunomarcación para Doblecortina. Además, encontramos una elevada infiltración de células microgliales en el hipocampo. En aras de investigar las vías biológicas del hipocampo asociadas al envejecimiento, realizamos secuenciamiento de ARN para análisis de expresión génica diferencial entre hipocampo joven y senil. Esto nos permitió descubrir que en el hipocampo senil están exacerbadas las vías de la respuesta inflamatoria, lo cual corroboró nuestra observación microscópica de infiltrados microgliales. Además, descubrimos una impronta transcriptómica conservada en humanos de 11 genes sobreexpresados en el hipocampo senil. Estos estarían implicados en una función biológica común que promueva una reacción inflamatoria exacerbada en el envejecimiento. Este último hallazgo dio lugar a nuevas líneas de investigación en nuestro laboratorio, entre ellas el rol de la proteina Tyrobp en la respuesta microglial frente a fenómenos de envejecimiento cerebral y gliomas de diverso grado. Los niveles cerebrales del Factor de Crecimiento Insulino Símil 1 (IGF-I) caen con el envejecimiento. Por lo tanto, el IGF-I emerge como una molécula neuroprotectora de especial interés para la implementación de terapia génica de sobreexpresión. Por lo tanto, para este trabajo realizamos dos estudios de terapia génica con IGF-I en ratas seniles: uno de corto y otro de largo plazo. En nuestro experimento de corto plazo realizamos un protocolo corto de entrenamiento en el Laberinto de Barnes y encontramos que, dos semanas después de la terapia, ratas de 28 meses tuvieron mayor precisión de memoria espacial, así como un aumento en su recuento de neuronas inmaduras inmunomarcadas para Doblecortina en el hipocampo. Además, un análisis microscópico de células astrogliales inmunarcadas para Proteina Glial Fibrilar Ácida nos permitió observar que la terapia estimuló un incremento en la arborescencia proximal en las prolongaciones de astrocitos hipocampales. En nuestro experimento de terapia génica con IGF-I de largo plazo, realizamos sobre ratas de 24 meses un protocolo de test de comportamiento más extenso y observamos un rendimiento superior debido a la terapia cuando las ratas cumplieron 28 meses, lo cual sugiere que la efectividad de la terapia es mayor cuanto más avanzado está el envejecimiento. El análisis del transcriptoma reveló que la terapia génica estimuló la sobreexpresión de genes relacionados a actividad sináptica, a las vías de señalización del IGF-I y a la neurogénesis. Entre este último grupo de genes se encontró que la terapia génica indujo sobreexpresión de Doblecortina, lo cual respaldó nuestro experimento de corto plazo. Este trabajo ha sentado las bases para evaluar la memoria espacial en ratas jóvenes y viejas mediante el Laberinto de Barnes, además hemos demostrado la efectividad de la terapia génica con IGF-I para tratar el déficit cognitivo relacionado a la edad. Por otra parte, se han generado nuevas líneas de investigación de acuerdo a nuestros hallazgos de cambios transcriptomales del hipocampo asociados al envejecimiento. Finalmente, se discuten para abordarse en el futuro terapias génicas con vectores bicistrónicos codificantes para IGF-I y marcadores fluorescentes así como terapias celulares novedosas para mejorar el déficit cognitivo mediante las tecnologías de reprogramación celular seguidas de transplante.

El ganglio linfático drenante del tumor (NLDT) es central en el primado de células T contra antígenos tumorales y en el inicio de la respuesta antitumoral. Sin embargo, también allí el tumor generaría inmunosupresión y tolerancia. La tolerancia no sólo favorece el crecimiento tumoral sino que constituye un obstáculo para el éxito de las inmunoterapias. Utilizamos un fibrosarcoma murino tempranamente inmunogénico que evoluciona hacia un estado tolerogénico, con el fin de estudiar los mecanismos celulares que llevan a la generación de la tolerancia a nivel del NLDT y de diseñar un tratamiento inmunológico apropiado. Determinamos que tras una activación inicial, se induce el aumento de células plasmacitoides, linfocitos B-IL10+ y T regulatorios, todos ellos asociados con inmunosupresión, los cuales coexisten con signos de inmunidad antitumoral locales y sistémicos. Por lo tanto evaluamos la utilidad de extirpar el NLDT como medio de eliminar un foco de inmunosupresión y favorecer el rechazo del tumor; por el contrario se indujo exacerbación del mismo. La restitución de las células efectoras del ganglio extraído conjuntamente con la depleción in vivo de células regulatorias por una dosis baja de ciclofosfamida resultó en menor crecimiento, mayor sobrevida y una alta tasa de regresión tumoral, sin recidivas. Parte de los mecanismos involucrados en la regresión comprenden la disminución del número y la actividad de las células regulatorias, la disminución de la producción de TGF-β, y el aumento de la citotoxicidad específica.