Catálogo de publicaciones

El envejecimiento cognitivo y su expresión más devastadora, la enfermedad de Alzheimer (EA), representan un creciente desafío médico y socioeconómico que requiere vigorosos esfuerzos de investigación para dilucidar los mecanismos fisiopatológicos que intervienen el cerebro y para el desarrollo de estrategias terapéuticas. Más aún, la EA esporádica (EAE) es la patología neurodegenerativa más frecuente y se espera que el número de personas afectadas continúe creciendo de manera exponencial. Desafortunadamente no existe un tratamiento disponible que revierta o prevenga la muerte neuronal que resulta en el inevitable deterioro cognitivo de los pacientes con EA. Es por ello que, la combinación de un diagnóstico temprano y una terapia efectiva resulta imprescindible para frenar el progresivo aumento de casos dado por la mayor expectativa de vida. Desde hace unos años, existe un creciente interés en el potencial de las células madre mesenquimales (MSCs) para implementar medicina regenerativa en el cerebro, ya que han demostrado actividades neurogénicas e inmunomoduladoras. En la presente Tesis Doctoral evaluamos en primer lugar, el efecto de la administración intracerebroventricular (icv) de MSCs derivadas de médula ósea humana (hBM-MSCs) en la memoria espacial y en la morfología del hipocampo de ratas seniles (27 meses). Después del tratamiento, el grupo senil tratado con MSCs mostró una mejora significativa en la memoria espacial, evaluada en el Laberinto de Barnes (BM). Respecto a la morfología del hipocampo, la terapia con MSCs aumentó el número de neuroblastos en el giro dentado, redujo el número de células microgliales reactivas y restauró la pérdida sináptica en comparación con los controles seniles. Llegamos a la conclusión de que las hBM-MSCs inyectadas icv son eficaces para mejorar la memoria espacial y algunas características cerebrales funcionales y morfológicas típicamente alteradas en ratas envejecidas. Para contribuir al estudio de la EA es necesario disponer de modelos animales que recapitulen las principales características patológicas de esta enfermedad. La inyección icv de estreptozotocina (STZ) en ratas constituye un modelo prometedor, ya que los animales desarrollan un estado cerebral insulino-resistente y deficiencias cognitivas. Aunque numerosos estudios han descripto a este modelo como representativo de la EAE, aún se necesitan más estudios para caracterizarlo completamente. En el presente trabajo, evaluamos los efectos a corto plazo de la inyección de STZ-icv a dos dosis, 1 (STZ1) y 3 mg/kg (STZ3), sobre el comportamiento y la morfometría del hipocampo. Encontramos que, después de la administración de STZ-icv, las ratas STZ3, pero no las STZ1, presentaban alteraciones en la memoria espacial en el BM y en la memoria de reconocimiento de objetos. Además, las ratas STZ3 mostraron una reducción del volumen y pérdida de neuronas del hipocampo, junto con un aumento de marcadores de microgliosis y astrogliosis (neuroinflamación). El análisis de Sholl reveló la vulnerabilidad de los astrocitos hipocampales a ambas dosis de STZ. En general, el presente estudio proporciona datos relevantes sobre este modelo de EAE en rata, en el cual solo la dosis alta de STZ induce lesiones neurodegenerativas severas y agudas, asociadas con un proceso inflamatorio. En este modelo de EAE decidimos evaluar la terapia con MSCs puesto que obtuvimos resultados prometedores en los estudios en ratas seniles. Para ello, inyectamos crónicamente MSCs por vía intravenosa (iv). Comprobamos que la terapia celular aumentó el comportamiento exploratorio y de enterramiento defensivo, disminuyó la ansiedad y mejoró la memoria espacial, afectados por la STZ. Un hallazgo interesante es que la terapia celular rescató a los animales de la neurodegeneración, pero no revirtió la pérdida de neuroblastos inducidas por la STZ en el hipocampo. Además, la terapia celular disminuyó significativamente la microgliosis y la disfunción sináptica en el hipocampo. Concluimos que, bajo nuestro protocolo de inyección, la terapia iv con MSCs en ratas con STZ induce a nivel estructural, bioquímico y funcional una neuroprotección integral en el hipocampo que promueve claras mejoras comportamentales. Otro modelo animal de EA, generado por la administración icv de oligómeros del péptido beta amiloide (OβAs) en ratones, fue utilizado en el presente trabajo de Tesis Doctoral. Evidencia considerable indica que los OβAs se acumulan en el cerebro con EA, y están implicados en la disfunción sináptica temprana y en el deterioro de la memoria en dicha enfermedad. Anteriormente, se ha establecido que la exposición de neuronas hipocampales a OβAs induce la internalización de los receptores de insulina (RI) y la inhibición del sustrato 1 del receptor de insulina (IRS-1), generando resistencia a la insulina neuronal. Aunque la insulina parece mejorar la cognición en los individuos controles y en las primeras etapas de la EA, los efectos protectores pueden no observarse en las últimas etapas de la enfermedad. Las posibles explicaciones para esto incluyen la eliminación de los RI de la superficie neuronal y el bloqueo de la señalización del RI debido a la inhibición de IRS-1 instigada por oligómeros. En nuestro estudio, hemos investigado si el factor de crecimiento símil insulina 1 (IGF-1) podría utilizarse para evitar el bloqueo de la señalización mediada por el RI y promover la activación alternativa de vías relacionadas con la insulina, protegiendo así a las neuronas del daño inducido por OβAs. Primero realizamos estudios in vitro que nos permitieron determinar que la exposición a OβAs en cultivos de neuronas hipocampales no afectaba los niveles del receptor IGF-1 en la superficie celular. Para evaluar nuestra hipótesis empleamos in vitro, previo a la exposición a OβAs (500 nM), un vector adenoviral recombinante (RAd-IGF-1) que induce la sobreexpresión de IGF-1. A pesar de observar solo una ligera disminución en la pérdida de espinas dendríticas, la expresión de IGF-1 mediada por el RAd previno la unión de OβAs a las neuronas y la producción excesiva de especies reactivas del oxígeno. A continuación, utilizamos un modelo in vivo en ratones para estudiar el impacto de la inyección icv de RAd-IGF-1, dos semanas antes de la infusión de OβAs-icv. Resulta de interés que, la sobre expresión del IGF-1 en el cerebro de los ratones protege contra el deterioro de la memoria de reconocimiento de objetos inducido por OβAs. Los resultados sugieren que la terapia génica con RAd-IGF-1 es una estrategia prometedora para proteger contra la neurodegeneración y el deterioro cognitivo inducido por los OβAs. Finalmente, teniendo en cuenta que la neuroinflamación es una característica típica tanto del envejecimiento como en la EA, resulta interesante disponer de herramientas para su modulación. En el laboratorio hemos empleado terapia génica con el péptido tímico timulina basada en su rol neuroinmunoendocrino. Actualmente estamos interesados en explorar el potencial antiinflamatorio de la timulina en los modelos animales de neurodegeneración. Para ello, inicialmente, nos propusimos generar una herramienta biotecnológica que nos permita manipular la expresión de la timulina, así fue que construimos un sistema bidireccional regulable Tet-Off de dos vectores (que llamamos sistema bivectoral experimental, ETV), el cual expresa simultáneamente el gen sintético para timulina y el gen para proteína verde fluorescente humanizada (hGFP) y, además, el sistema control correspondiente. La expresión de los transgenes se desactiva en presencia del antibiótico doxiciclina (DOX). ETV se caracterizó in vitro, en diferentes líneas celulares, e in vivo, administrado icv y por vía intramuscular; en todos los casos ETV mostró inducir niveles elevados de timulina y ser eficientemente regulado por DOX. Por tanto, creemos que nuestro sistema bivectorial regulable es una herramienta molecular eficaz para implementar terapia génica antiinflamatoria con timulina, a corto y largo plazo, en modelos animales de inflamación aguda o crónica.

En la literatura médica son cada vez más frecuentes las publicaciones acerca de la utilidad de las determinaciones seriadas de diversos biomarcadores como predictores de daño miocárdico progresivo en la IC. Los más estudiados han sido la troponina T (TnT) y los péptidos natriuréticos, especialmente el tipo B (BNP) y su precursor, pro BNP. La proteína C reactiva (PCR) también ha sido estudiada en este contexto. El rol de nuevos biomarcadores como el propéptido del procolágeno tipo I (PICP), un marcador de fibrosis, algunas citokinas como la interleukina 6 (Il6), marcadoras de inflamación, y la proteína ligadora de ácidos grasos específica del corazón (HFABP), marcadora de injuria miocárdica, ha sido menos estudiado y se conoce menos sobre su implicación pronóstica en IC.

El 75% de los tumores de mama son positivos para receptores de estrógeno y progesterona y el tamoxifeno es la terapia más utilizada. Se propone que las células stem podrían ser iniciadoras de tumores y que tendrían una menor susceptibilidad a la quimio y radioterapia. El objetivo fue estudiar el efecto del tamoxifeno y de los elementos del microambiente tumoral sobre las poblaciones con propiedades stem y los mecanismos involucrados utilizando las líneas LMO5-E murina y MCF-7 humana in vitro y el tumor M05 in vivo. Se realizaron ensayos de mamoesferas, de actividad de la enzima ALDH1 y clonogénicos para estudiar a las células con propiedades stem y también se evaluó el crecimiento de los tumores in vivo y de las líneas in vitro y su expresión génica y proteica. Se observó que el tamoxifeno llevó a un enriquecimiento de células con propiedades stem in vivo e in vitro y que estos cambios perduraron luego de finalizado el tratamiento. Los elementos del microambiente tumoral redujeron la proporción de células con estas propiedades probablemente induciendo su diferenciación. De los resultados podemos concluir que el tamoxifeno podría llevar a un enriquecimiento de células con propiedades stem el cual podría ser responsable de las recurrencias observadas luego de la finalización del tratamiento apoyando los estudios que indican que prolongar el tratamiento a 10 años es más efectivo.

Fil:Perotti, Christian Pablo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En las últimas décadas, el promedio en la esperanza de vida de la población mundial ha aumentado debido a la mejora en la atención médica y las condiciones sociales y culturales. Este hecho viene de la mano con el consecuente deterioro motor y cognitivo, así como a un aumento en la incidencia de patologías relacionadas al envejecimiento, como es la Enfermedad de Parkinson. Durante el envejecimiento se observa una pérdida de la homeostasis cerebral y una neuroinflamación crónica, causada principalmente por microglia senescente. Estas células se encuentran polarizadas hacia un fenotipo proinflamatorio y generan una respuesta inmune exacerbada. De hecho, ha sido reportado que la progresión de muchas enfermedades neurodegenerativas depende de la activación de la microglia. Por tanto, es de gran interés diseñar estrategias que permitan modular el fenotipo de estas células gliales. Muchos factores neurotróficos producidos por las células gliales, como el IGF1, pueden polarizarlas hacia un fenotipo neuroprotector M2, promoviendo la supervivencia neuronal. Nuestro grupo de investigación ha fijado como objetivo de estudio combatir los efectos deletéreos del envejecimiento en ratas seniles mediante la implementación de la terapia génica con IGF1. En el presente trabajo de Tesis Doctoral hemos evaluado el efecto de esta terapia sobre la microglia en regiones del cerebro relacionadas con el desempeño motor, y su relación con la mejora en la performance motora debida a la terapia, anteriormente observada. Demostramos que la terapia génica con IGF1 aumenta el número de células microgliales con especificidad en el Núcleo Estriado de ratas seniles. Además, estas células presentan una mayor reactividad y se encuentran polarizadas hacia un fenotipo anti-inflamatorio M2. Observamos también que la microglia del Núcleo Estriado en ratas seniles tratadas con RAd-IGF1 presentan una mayor actividad fagocítica y mayor remodelación sináptica. A su vez, la terapia génica provocó una disminución en la expresión de genes pro-inflamatorios. Postulamos que estos cambios debidos a la sobreexpresión de IGF1, establecen un microambiente propicio para el correcto funcionamiento de las neuronas implicadas en el control motor generando una mejora de la conducta motora.

La timulina es una hormona producida exclusivamente por las células epiteliales tímicas; consiste en un nonapéptido biológicamente inactivo (facteur thymique sérique o FTS) coordinado al ión Zn⁺² en una relación equimolecular 1:1, lo cual le confiere su actividad biológica característica. La timulina participa en la diferenciación de los linfocitos T y en la modulación de varias de sus funciones. Los niveles circulantes de esta hormona se encuentran disminuidos durante el envejecimiento normal y en patologías tales como el SIDA y el síndrome de DiGeorge, una enfermedad caracterizada por la ausencia congénita del timo y de las glándulas parótidas. La secreción de timulina está influenciada por una compleja trama endocrina que incluye a la mayoría de las hormonas adenohipofisarias y periféricas. Recíprocamente, existe evidencia de que además de su acción inmunomoduladora, la timulina posee actividad hipofisotrófica in vitro y, por lo tanto, puede actuar directamente sobre la adenohipófisis in vivo, modulando la respuesta de la glándula a secretagogos o inhibidores hipotalámicos. En los últimos años, un número creciente de estudios coloca a la timulina como un mediador fisiológico (el primero descripto) del eje timo-cerebro-hipófisis. Además, existe evidencia de que la timulina estimula la liberación de citoquinas de ciertos tipos de linfocitos y de que posee actividad antiinflamatoria y analgésica en el sistema nervioso central y en modelos de inducción de la inflamación, a nivel periférico y local. La actividad endocrina y antiinflamatoria de este metalopéptido ha generado un creciente interés en la posibilidad de implementar estrategias de terapia génica para timulina en situaciones de disfunción tímica o en patologías cerebrales asociadas a procesos inflamatorios. Desafortunadamente, hasta el momento no se ha logrado clonar el gen de la timulina. Esta situación nos condujo a diseñar una secuencia sintética de ADN codificante para un análogo biológicamente activo de timulina, metFTS, la cual fue clonada en vectores de expresión apropiados, a fin de caracterizar las propiedades biológicas de dicho análogo tanto in vitro como in vivo. Una vez demostrada la funcionalidad del gen sintético diseñado, se construyó un vector adenoviral recombinante (RAd-FTS) portador de dicho gen sintético para implementar estrategias de terapia génica in vivo en modelos animales de timodeficiencia. Uno de estos modelos, el ratón congénitamente atímico (nude), exhibe ciertas deficiencias reproductivas que parecen estar directamente vinculadas a su carencia de hormonas tímicas circulantes. En efecto, pocos días después del nacimiento, tanto el ratón nude como el ratón normal neonatalmente timectomizado, desarrollan, además de un severo cuadro de inmunodeficiencia, una serie de alteraciones degenerativas en las glándulas tiroides, adrenales y expresan severas deficiencias en su función reproductiva. El vector adenoviral RAd-FTS logró una restauración prolongada de los niveles de timulina circulante cuando fue inyectado intramuscularmente en ratas y ratones adultos timectomizados. Asimismo, la terapia génica neonatal para timulina en la hembra nude, logró restaurar los niveles de timulina sérica y prevenir las alteraciones a nivel hipotalámo-gonadotropo-ovárico que típicamente ocurren en estos mutantes en la adultez. Consecuentemente, estos resultados señalan a la timulina como el mediador fisiológico, o al menos uno de los mediadores, de la influencia perinatal del timo sobre la maduración del eje hipotálamo-hipófisogonadal. Dicha influencia podría ejercerse a través del sistema neuroendocrino y/o directamente a nivel ovárico. Nuestros resultados se suman a la evidencia de que la timulina juega un rol fisiológico relevante como mediadora de la influencia perinatal del timo sobre la maduración del eje reproductivo y sugieren que terapia génica con el gen sintético para la timulina puede constituir una estrategia terapéutica efectiva para el abordaje de déficits reproductivos asociados con disfunciones endocrinas del timo.

En humanos y ratas, el envejecimiento está asociado a un progresivo deterioro del aprendizaje y la memoria espacial. Además, el envejecimiento trae aparejado cambios morfométricos en el hipocampo, una estructura clave en la formación y consolidación de la memoria. Uno de estos cambios es una reducción dramática de la neurogénesis en la región del Giro Dentado. La rata senil presenta cambios similares al humano en la morfometría de su hipocampo y, además, tiene un desempeño inferior al de la rata joven en pruebas de memoria espacial; por lo tanto, es un excelente modelo de investigación básica para desarrollar terapias novedosas contra el deterioro cognitivo asociado al envejecimiento. Previamente en nuestro laboratorio se puso a punto la metodología del estudio de la memoria espacial en ratas mediante el Laberinto de Barnes. En este trabajo de tesis estudiamos en mayor profundidad el impacto que tienen protocolos de variada intensidad sobre la habituación comportamental en nuestra colonia de ratas y descubrimos que la memoria espacial puede ser evaluada hasta un máximo de tres veces, tiempo después del cual los sujetos se habitúan a la tarea. Además, luego de poner a punto la tinción de Golgi, descubrimos que el mero hecho de estar expuestas al test cognitivo por tres meses indujo en las ratas un incremento en la densidad de espinas dendríticas de neuronas del hipocampo. Habiendo sentado las bases para el protocolo del Laberinto de Barnes para la evaluación de la memoria espacial en nuestra colonia de ratas, nos dispusimos a estudiar las diferencias comportamentales entre ratas jóvenes y seniles. Encontramos que las ratas seniles presentan un desempeño muy pobre en comparación con las jóvenes en el paradigma del Laberinto de Barnes. Luego nos preguntamos si este deterioro cognitivo tendría su correlato a nivel morfométrico y molecular en el hipocampo. En este sentido encontramos que el hipocampo senil presenta una dramática reducción en la tasa de neurogénesis, evaluada por inmunomarcación para Doblecortina. Además, encontramos una elevada infiltración de células microgliales en el hipocampo. En aras de investigar las vías biológicas del hipocampo asociadas al envejecimiento, realizamos secuenciamiento de ARN para análisis de expresión génica diferencial entre hipocampo joven y senil. Esto nos permitió descubrir que en el hipocampo senil están exacerbadas las vías de la respuesta inflamatoria, lo cual corroboró nuestra observación microscópica de infiltrados microgliales. Además, descubrimos una impronta transcriptómica conservada en humanos de 11 genes sobreexpresados en el hipocampo senil. Estos estarían implicados en una función biológica común que promueva una reacción inflamatoria exacerbada en el envejecimiento. Este último hallazgo dio lugar a nuevas líneas de investigación en nuestro laboratorio, entre ellas el rol de la proteina Tyrobp en la respuesta microglial frente a fenómenos de envejecimiento cerebral y gliomas de diverso grado. Los niveles cerebrales del Factor de Crecimiento Insulino Símil 1 (IGF-I) caen con el envejecimiento. Por lo tanto, el IGF-I emerge como una molécula neuroprotectora de especial interés para la implementación de terapia génica de sobreexpresión. Por lo tanto, para este trabajo realizamos dos estudios de terapia génica con IGF-I en ratas seniles: uno de corto y otro de largo plazo. En nuestro experimento de corto plazo realizamos un protocolo corto de entrenamiento en el Laberinto de Barnes y encontramos que, dos semanas después de la terapia, ratas de 28 meses tuvieron mayor precisión de memoria espacial, así como un aumento en su recuento de neuronas inmaduras inmunomarcadas para Doblecortina en el hipocampo. Además, un análisis microscópico de células astrogliales inmunarcadas para Proteina Glial Fibrilar Ácida nos permitió observar que la terapia estimuló un incremento en la arborescencia proximal en las prolongaciones de astrocitos hipocampales. En nuestro experimento de terapia génica con IGF-I de largo plazo, realizamos sobre ratas de 24 meses un protocolo de test de comportamiento más extenso y observamos un rendimiento superior debido a la terapia cuando las ratas cumplieron 28 meses, lo cual sugiere que la efectividad de la terapia es mayor cuanto más avanzado está el envejecimiento. El análisis del transcriptoma reveló que la terapia génica estimuló la sobreexpresión de genes relacionados a actividad sináptica, a las vías de señalización del IGF-I y a la neurogénesis. Entre este último grupo de genes se encontró que la terapia génica indujo sobreexpresión de Doblecortina, lo cual respaldó nuestro experimento de corto plazo. Este trabajo ha sentado las bases para evaluar la memoria espacial en ratas jóvenes y viejas mediante el Laberinto de Barnes, además hemos demostrado la efectividad de la terapia génica con IGF-I para tratar el déficit cognitivo relacionado a la edad. Por otra parte, se han generado nuevas líneas de investigación de acuerdo a nuestros hallazgos de cambios transcriptomales del hipocampo asociados al envejecimiento. Finalmente, se discuten para abordarse en el futuro terapias génicas con vectores bicistrónicos codificantes para IGF-I y marcadores fluorescentes así como terapias celulares novedosas para mejorar el déficit cognitivo mediante las tecnologías de reprogramación celular seguidas de transplante.