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Tesis (Magister en Aplicaciones Espaciales de Alerta y Respuesta Temprana a Emergencias)--Universidad Nacional de Córdoba, Facultad de Matemática, Astronomía y Física, 2016.

Tricepiro es un cereal sintético de alto valor forrajero, que fue obtenido por el Ing. Covas en 1972. Lo logró cruzando triticale Don Santiago INTA(2n=42) por trigopiro Don Noé INTA(2n=56). Luego de varios años de mejoramiento logró la linea 3-40 que fue inscripta en 1994 como cultivar con el nombre de tricepiro Don René INTA.Esta línea, que presenta resistencia a enfermedades y es tolerante al frío y a la salinidad del suelo, constituye un material apto para ser usado en programas de mejoramiento. Dentro de los objetivos de la presente tesis estuvieron. Establecer y comparar los patrones electroforéticos de gluteninas de alto peso molecular (HMW)de tricepiro Don René INTA y de sus progenitores, así como determinar la existencia de variabilidad para dichas proteínas en lineas hermanas del cultivaren estudio. Determinar la estabilidad meiótica de tricepiro Don René INTA mediante el estudio de la meiosis masculina. Establecer la relación entre la rugosidad de las semillas y el contenido de heterocromatina telomérica de los cromosomas de centeno, en lineas de tricepiro Determinar la composición genómica de tricepiro Don René INTA e individualizar sus cromosomas mediante técnicas de citogenética clásica y molecular. La electroforesis de proteinas seminales (SDS-PAGE) mostró que tricepiro Don René INTA tiene cinco bandas correspondientes a gluteninas (HMW), ninguna de las cuales le es propia. De las cinco bandas, cuatro las comparte con ambos progenitores y la quinta la comparte sólo con trigopiro Don Noé INTA. Esta banda podría provenir de Thinopyrum. Las 9 lineas hermanas de tricepiro Don René INTA que se estudiaron tienen las cinco bandas que presenta el cultivar. Dos de estas líneas, tienen una banda adicional, FA-L2 la comparte con trigopiro Don Noé INTA y FA-L66 tiene una banda propia. Los estudios meióticos de tricepiro Don René INTA mostraron la formación de 21 II en diacinesis. Sin embargo, en Metafase I se observaron asincronías en el comportamiento cromosómico tales como bivalentes que segregaban tempranamente y presencia de univalentes fuera de la placa ecuatorial. El comportamiento meiótico no reveló la presencia de heterocigosis para alteraciones numéricas ni estructurales. El número de micronúcleos presentes en las tetradas osciló entre 0 y 9 y se calculó un Índice Meiótico de 66,47. Se hizo bandeo C y DAPI en cromosomas mitóticos de tricepiro Don René INTA. Se observaron 14 cromosomas con importantes bandas teloméricas atribuibles a cromosomas de centeno y 14 cromosomas con numerosas bandas intersticiales, supuestamente pertenecientes al genoma B de trigo, de acuerdo con patrones usados internacionalmente. Tricepiro Don René INTA posee semillas rugosas, mientras que la línea FA-L2 tiene semillas lisas. Se determinó que el tamaño de las bandas teloméricas del genoma R es similar en ambas lineas. Por lo tanto, las caracteristicas rugosidad de las semillas y tamaño de las bandas teloméricas de los cromosomas de centeno no muestran asociación . Los estudios de hibridación in situ con ADN genómico total de Secale cereale y Thinopyrum bessarabicum como sondas y Triticum aestivun var Chinese Spring como bloqueante (GISH) mostraron que Tricepiro Don René INTA tiene 14 cromosomas de centeno y 28 de trigo. En un par de estos últimos se detectó introgresión de Thinopyrum. La identificación de todos los cromosomas del hibrido se logró haciendo hibridación con las sondas pSc 119.2 y pAs1 (FISH). La composición genómica y la constitución cromosómica de tricepiro Don René INTA es la siguiente: 7 pares de cromosomas de centeno (1R, 2R, 3R, 4R, 5R, 6R, 7R); 7 pares de cromosomas del genoma A de trigo (1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A); 7 pares de cromosomas del genoma B de trigo (1B, 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B). Introgresión del genoma J de Thinopyrum (posiblemente Th. ponticum 2n=70) en un par cromosómico del genoma A, que por su morfología y su tamaño podría ser el 6A.

Oxalis tuberosa, comúnmente conocida como oca, es una de las 8 especies andinas con raíces y tubérculos comestibles que juegan un rol importante en los sistemas agrícolas de las tierras altas de la región andina. Estos cultivos son de gran importancia económica y nutricional para la subsistencia de los agricultores de los Andes y un potencial alimento para el resto de la humanidad. La oca pertenece al género Oxalis, el cual está distribuido mundialmente e incluye alrededor de 800 especies. La mayor diversidad se encuentra en América del Sur y en Sud Africa; siendo las especies de América del Sur las que presentan el mayor rango de variación en cuanto a características morfológicas, ecológicas y citológicas. Los estudios citogenéticos revelaron una gran diversidad en el número básico de cromosomas variando desde X=5 a X=12, siendo X=7 el número más frecuente. Los niveles de poliplodía en el género también son variables (2n a 8n). De Azkue y Martínez (l990) encontraron que un grupo de once especies, que eran semejantes morfológicamente, compartían un número básico de cromosomas X=8. A este grupo pertenecen O. herrerae, O. medicaginea, O. mollissima, O. oblongiformis, O. peduncularis, O. subintegra, O. tabaconanensis. O.aff. víllosula (todas estas diploides), O. lotoides (2n=32), O. spiralis (2n=48) y la oca (O. tuberosa), un octoploide. A este grupo lo denominaron “la alianza de O. tuberosa”. Sin embargo este agrupamiento no coincide con la clasificación basada en criterios de taxonomía tradicional. El estudio de las especies silvestres relacionadas a los cultivos puede dar idea del proceso de domesticación y la evolución de los mismos, por otro lado pueden tener aplicaciones prácticas dado que las especies silvestres relacionadas a los cultivos son reservorios genéticos para el mejoramiento de los mismos. La caracterización de las distintas variedades y accesiones de O. tuberosa que existen es fundamental para saber con la diversidad que se cuenta y para el manejo de los bancos de germoplasma. Dentro de este marco los objetivos generales del presente estudio fueron por un lado poner a prueba, con herramientas de la taxonomía molecular, la hipótesis cromosómica que relaciona a O. tuberosa y con otras especies del género por compartir el mismo número básico de cromosomas X=8. Por otro lado evaluar distintas herramientas moleculares para cuantificar y comparar la diversidad genética de representantes del género y, más particularmente, de la especie cultivada, con el objeto de contribuir criterios objetivos para la conservación de estos recursos genéticos y su mejoramiento con fines agrícolas. Para lo cual se realizó el análisis de los genes ribosomales y se analizaron patrones de AFLP. El análisis de la región del espaciador interno de los genes ribosomales (ITS) corroboró la hipótesis cromosómica que relaciona a O. tuberosa y las especies que comparten el mismo número básico de cromosomas X=8. El análisis de AFLP también apoyó la hipótesis cromosómica ya que tanto en el análisis de agrupamientos como en el análisis mediante coordenadas principales las especies de la alianza se diferenciaron respecto de O. articulata generándose en el primer caso un dendrograma que sostenía este agrupamiento con un coeficiente de correlación cofenética de 0,99. El segundo análisis permitió identificar a las combinaciones de primers E41-M39 y E45- M43 como las que más aportaron a dicho agrupamiento. Los resultados no son del todo consistentes con los obtenidos a través de la taxonomía tradicional mediante descripciones puramente morfológicas, tanto en el caso de las clasificaciones que dividen a las distintas especies de la alianza en cuatro secciones (Knuth, 1939, 1936) como el caso en que las dividen en dos (Lourteig, 2000). De todos modos, la clasificación basada en datos moleculares de las especies de la alianza es más congruente con la propuesta taxonómica de Lourteig (2000) y puede ayudar a afinarla. El análisis de los genes ribosomales a nivel de la región codificante (la más conservada), muestra mayor similitud entre O. tuberosa y O. oblongiformis. Esta observación, sí sería congruente con la taxonomía tradicional, ya que ambas especies fueron las únicas de las especies estudiadas, agrupadas en la misma sección por Knuth (en Ortgiesae) y por Lourteig (en Lotoideae). Lo incongruente sería que, en su monografía, Lourteig (2000) sinonimizó a O. oblongiformis con O. tabaconasensis. El análisis del ADNr, pero a nivel de la región del IGS (la más variable) dio una idea de la compleja estructura de estas secuencias hipervariables en la alianza. Dado que es una región altamente variable no esclareció demasiado la relación de las especies diploides y poliploide cultivada, pero aportó información interesante de la relación entre las especies diploídes. Las tres especies diploides que comparten el mismo patrón de bandas fueron ubicadas por Knuth en tres secciones diferentes, mientras que por Lourteig en dos. Así mismo, esta parte del ADNr demostraría la inconsistencia de sinonimizar O. oblongiformis y O. tabaconasensis (Lourteig 2000). El análisis de los resultados obtenidos por los AFLP aparte de apoyar la hipótesis cromosómica de la alianza, permitieron visualizar el potencial de la técnica de AFLP para la caracterización de las distintas accesiones del cultivo y su utilización para el manejo de los bancos de germoplasma. Ya que se permitieron diferenciar accesiones que figuran con el mismo número, como así también identificar posibles duplicados, accesiones que figuran con distinto número, pero tienen perfiles de bandas idénticos. Siendo las combinaciones de primers E45-M43, E69-M69 y E41-M39 las que más incidieron para explicar la variación observada.

Paspalum notatum es una gramínea forrajera nativa de las praderas naturales de las regiones subtropicales de América. Los citotipos diploides son de reproducción sexual y los poliploides, en su mayoría tetraploides, son apomícticos de tipo apospórico. La manipulación de la apomixis, reproducción asexual por semillas, puede tener un gran impacto en la agricultura, principalmente porque su introducción en especies de gran cultivo permitiría la propagación indefinida de genotipos híbridos en forma clonal. En P. notatum, la aposporía, un componente de la apomixis, está controlada por un locus complejo localizado en un fragmento cromosómico de gran tamaño, que presenta supresión de la recombinación y apareamiento preferencial de cromosomas con uno de los cuatro homólogos del grupo. Los análisis de secuencias de marcadores moleculares 100 % asociados al carácter mostraron homologías con elementos repetitivos, genes gag/pol de maíz y sectores no codificantes. El objetivo general de este trabajo fue llevar a cabo un análisis de los factores genéticos y epigenéticos asociados a la aposporía en la especie. En este estudio se analizaron las frecuencias, los patrones y la variación en la metilación de citosinas del ADN, en genotipos diploides y tetraploides. La técnica utilizada (MSAP) (“Methylation Sensitive Amplification Polymorphism”) está basada en la técnica de AFLP (“Amplified Fragment Length Polymorphism”) incluyendo en la etapa de digestión del ADN dos enzimas de restricción diferencialmente sensibles a la metilación. Las proporciones de los sitios CCGG metilados variaron entre 40 - 42 % y 31 - 41 % en diploides y tetraploides, respectivamente. al analizar el número total de sitios blanco metilados y no metilados se obtuvo diferencia significativa entre grupos. Los análisis de similitud basados en los polimorfismos sensibles a metilación mostraron que los tetraploides fueron significativamente más diversos que los diploides. Se encontró una correlación significativa entre la variación epigenética y no epigenética en ambos grupos. Varios marcadores mostraron estados de metilación diferentes en los distintos niveles de ploidía. El agrupamiento basado en las similitudes en cuanto a la metilación de citosinas, incluyendo todos los genotipos mostró que los cuatro diploides y uno de los tetraploides experimentales de reproducción sexual conforman un solo grupo indicando una estructura epigenética común. Varios marcadores MSAP que mostraron polimorfismos en cuanto a su estado de metilación entre los individuos Q4188 y Q4117 fueron ensayados en una población segregante F1 derivada de ambos. Este análisis demostró que varios de estos sitios se transmiten a la descendencia en forma mendeliana como alelos en dosis simple. Un análisis similar que se llevó a cabo con el citotipo diploide C4-2x y su autotetraploide derivado C4-4x (ambos de origen experimental) mostró que las dos plantas son muy similares tanto a nivel epigenético como genético aunque se detectaron polimorfismos asociados al nivel de ploidía. Las secuencias derivadas de algunos marcadores MSAP presentaron homología con secuencias codificantes, transposones/retrotransposones y secuencias no codificantes. Los resultados obtenidos en esta parte del trabajo indican que aunque la proporción de sitios metilados entre los dos niveles de ploidía es comparable, el patrón y la variación de los mismos difieren entre los citotipos. Más aun, luego de la tetraploidización se observó la generación de nuevos “epialelos” en la especie. Análisis de RFLP con clones que mapean en el locus responsable de la aposporía en combinación con enzimas sensibles a metilación mostraron que la región genómica se encuentra metilada e incluso se observan diferencias en el estado de metilación de algunos loci entre los genotipos sexuales y apomícticos. Se desarrolló un marcador específico de secuencia ligado completamente a la aposporía. La disponibilidad de este marcador simplificará y acelerará la identificación de individuos apomícticos en poblaciones segregantes y permitirá el escrutinio debibliotecas genómicas en futuras estrategias de clonado de los genes relacionados. Otra importante cualidad de este marcador fue su consistencia en diferentes fondos genéticos. Este marcador fue ensayado en citotipos diploides de la especie derivados de una población natural y se encontró que su frecuencia en la población es del 0.17. Por otro lado, se aislaron secuencias adyacentes a los marcadores de AFLP 100 % ligados a la aposporía mediante estrategias de caminata cromosomal. Se aislaron secuencias con homología a genes relacionados con la síntesis proteica, metilación de especies de ARN, retrotransposones y proteínas de tipo quinasa. Asimismo, se identificó un nuevo marcador ligado completamente a la aposporía en la especie cuya secuencia corresponde a una proteína con repeticiones de anquirina. Los resultados presentados en esta tesis muestran que tanto factores genéticos como epigenéticos están asociados a la apomixis en Paspalum. En particular el carácter aposporía estaría controlado por un locus complejo que incluye secuencias codificantes y no codificantes, elementos repetitivos y metilación de citosinas.

La fiebre aftosa (FA) es una enfermedad viral altamente contagiosa que afecta a animales de pezuña hendida, como vacunos y porcinos; es causante de epidemias repentinas que acarrrean grandes pérdidas económicas. El control de esta enfermedad se realiza mediante la aplicación regular de vacunas a virus inactivado que son efectivas, pero que poseen el riesgo de re-introducción de la enfermedad debido al manipuleo de grandes cantidades de vian infeccioso o por la inactivación incompleta del antígeno. Este trabajo tiene por objetivos establecer parámetros serológicos que puedan ser útiles para la evaluación del nivel de protección de los animales, y el desarrollo de una estrategia de vacunación alternativa que conjugue seguridad y bajos costos. En primer lugar se evaluó la respuesta imnune humoral y su eventual correlación con el grado de protección contra la fiebre aftosa. Se estableció una correlación entre los niveles de isotipo IgG1 especificos contra VFA y protección. En una segunda parte, se construyeron genes quiméricos codificantes del gen para la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G),una glicoproteína altamente inmunogénica que posee epitopes T funcionales, como carrier del principal sitio antigénico presente en la proteína capsidal VP1 de VFA (ASA), blanco de la respuesta neutralizante. Estos genes quiméricos, uno con la secuencia entera de la G y otro con una deleción de la zona central y 3’, fueron expresados y caracterizados antigénicamente en sistemas libre de células y por transfección de células de mamíferos. Las proteínas quiméricas lograron exponer el epitope elegido en la conformación adecuada, similar sino idéntica a la presente en los viriones. Las construcciones expresadas en el sistema Baculovirus recombinante-céluias de insecto fueron inoculadas i.m. en bovinos en dos dosis de 30 ó 100 μg. La versión delecionada indujo una respuesta humoral con altos niveles de IgG1 y buena actividad neutralizante a los 90 días post vacunación (d.p.v). Se evaluaron las mismas construcciones como vacunas genéticas. Ratones vacunados con ADN codificante para estas quimeras respondieron con un perfil de respuesta Th1, presentando altos niveles de IgG2a. Bovinos vacunados con ADN codificante de la versión delecionada de la quimera, desarrollaron títulos de IgG1 anti VFA específicos tras una sola dosis (15 d.p.v) de 150 μg, pero los niveles de IgG2 prevalecieron a partir de los 45 d.p.v. En este trabajo se propone una estrategia de control de la FA mediante vacunación, combinando la utilización de proteinas recombinantes y ADN a fin de lograr una respuesta protectiva a largo plazo, sin los riesgos asociados a las vacunas a virus inactivado.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015

La expansión de la frontera agrícola ha afectado las poblaciones silvestres animales en Argentina. Particularmente la distribución natural de la iguana overa (Salvator merianae) ha quedado inmersa en áreas expuestas a plaguicidas. El sistema inmune es un excelente indicador de la salud de los organismos, por lo que este trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto de los agroquímicos más utilizados en el país (cipermetrina, glifosato y clorpirifos) y de sus combinaciones, sobre el sistema inmune de S. merianae. Los parámetros inmunológicos evaluados fueron: recuento total y diferencial de glóbulos blancos, índices de lobularidad y de heterófilos/linfocitos, anticuerpos naturales y actividad del sistema de complemento. Complementariamente, se evaluaron los niveles de corticosterona en sangre y el crecimiento corporal de los individuos. Los resultados sugieren que los plaguicidas aplicados en menores concentraciones que las utilizadas en la agricultura actual, pueden inducir alteraciones en el sistema inmune de embriones y juveniles de S. merianae. Las diferentes respuestas inmunológicas, endócrinas y/o de crecimiento dependieron de las características del formulado, de la marca comercial probada y el método de exposición: individual o combinado, reconociendo interacciones entre los componentes de las mezclas. En animales expuestos durante el desarrollo embrionario, los efectos también dependieron de las diferentes concentraciones y de la etapa embrionaria de los individuos al momento de la exposición. En base a los resultados obtenidos, se sugiere continuar con la evaluación de los efectos de plaguicidas, empleando biomarcadores que permitan identificar las condiciones reales de exposición en las que se encuentra esta especie en su ambiente natural.