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El presente trabajo tiene como objetivo generar un sistema para ser utilizado como herramienta en técnicas de genética reversa vinculadas al estudio del virus de la Fiebre Aftosa. Se diseñó y construyó un clon basado en una copia en ADN del genoma completo de la cepa O1/Campos, que se transcribe a partir del promotor de la polimerasa del fago T7. A pesar de detectar replicación del genoma viral por identificación de ARN de cadena negativa en las células transfectadas y en pasajes sucesivos de éstas, no se observó generación de efecto citopático en células BHK-21. Se valoró la influencia de algunos cambios en nucleótidos sobre esta incapacidad, tales como mutaciones en la secuencia amino acídica, estructura secundaria del ARN, estructura secundaria y terciaria de las proteínas involucradas, y se generaron reversiones de las mutaciones que se consideraron más importantes. Se desarrolló un sistema de cuantificación de ARN viral por RT-PCR en Tiempo Real. Por otro lado, se generaron dos replicones mediante el remplazo parcial o completo de las proteínas de la cápside viral por el gen reportero Luc, incapaz de generar virus infeccioso, de modo de poder realizar estudios en laboratorios de nivel bioseguridad menos estrictos. Este sistema puede usarse para el estudio funcional de las proteínas no estructurales del virus, así como de las regiones 5’ y 3’ no codificantes. Se detectó replicación por identificación de ARN de cadena negativa en las células transfectadas así como traducción de proteínas virales por medio de técnicas de inmunofluorescencia indirecta.

La transferencia in vivo del gen de la timidina kinasa del virus herpes-1 seguido por la administración de la prodroga ganciclovir (HSV-tk/GCV) y su posterior activación in situ, surgió como una estrategia de terapia génica eficaz para el tratamiento de tumores experimentales y humanos. Se había demostrado la existencia de un efecto “bystander” por el cuál las células no modificadas por el gen también eran eliminadas por GCV activado por el gen HSV-tk. Sin embargo, su validez fue cuestionada desde diferentes perpectivas, entre ellas el sistema de transferencia y el modelo tumoral utilizado. Dada la disparidad de resultados en diferentes modelos experimentales, construimos un vector retroviral conteniendo el gen de HSV-tk y obtuvimos células productoras de vectores retrovirales (VPC). Utilizando dichas células como fuente de tranferencia génica, estudiamos la eficiencia de transducción in vivo en células malignas sobre tres modelos tumorales distintos: melanoma murino B16, melanoma humano IIB-MEL-LES y glioblastoma de rata C6. En estudios in vitro pudimos observar un efecto bystander sólo en células C6. Los estudios in vivo mostraron una inhibición del crecimiento tumoral en los dos modelos de melanoma cuando las células eran co-inoculadas con VPC productoras de vectores retrovirales portando el gen HSV-tk (VPC-tk) y tratadas con GCV. Sin embargo, el 100% de los animales fue capaz de desarrollar tumores en ambos modelos . Bajo las mismas condiciones experimentales, 70% de las ratas fueron capaces de rechazar células de glioma C6 transferidas de modo intracraneal por técnicas estereótaxicas y el 50% de los animales mostró un aumento significativoen el tiempo de sobrevida. El tratamiento de tumores C6 establecidos con VPC-tk y GCV, llevó a la cura del 33% de los animales. Las ratas que rechazaron el tumor primario fueron capaces de desarrollar una respuesta inmune de memoria que lleva al rechazo de desafíos contralaterales con células parentales. A los efectos de aumentar el efecto terapéutico estudiamos el efecto antitumoral de la tranferencia del gen de interleuquina-12 solo o en combinación con el gen HSV-tk y tratamiento con GCV, sobre tumores de cerebro intracraneales y los mecanismos involucrados en el rechazo tumoral. Luego de la transferencia i.c.de células productoras VPC-IL12, se lograba suprimir el crecimiento de tumores C6, aún en tumores establecidos de 10 días. La combinación con células VPC-tk y GCV tuvo mejor efecto terapéutico que los dos tratamientos por separado sobre tumores incipientes. Los estudios de los mecanismos asociados a la respuesta antitumoral demostraron la participación de eventos inmunológicos y no inmunológicos. Secciones histológicas de cerebros con expresión local de IL-12 mostraron una activación inmediata de macrófagos/microglia y su reclutamiento a áreas intratumorales. La expresión de IL-12 también fue capaz de estimular un reclutamiento de PMN e inducir necrosis de vasos tumorales, mientras los vasos del parénquima normal no se vieron afectados. Por otro lado, el tratamiento con HSV-tk/GCV mostró un infiltrado mayoritario de células CD5+. Además, únicamente la combinación de IL-12 y HSV-tk/GCV fue capaz de reclutar células CD4+ y CD8+ cuando el tratamiento era aplicado a tumores de gran tamaño. Los animales sobrevivientes desarrollaron una inflamación crónica en el sitio de inyección primario compuesto de macrófagos y linfocitos en distintas proporciones según el tipo de terapia inicial aplicado. Este infiltrado crónico no fue perjudicial para el cerebro ya que no se observaron evidencias de desmielinización ni tampoco daños neurológicos asociados. Por lo tanto este estudio provee las bases para comprender los mecanismos involucrados en la respuesta antitumoral inducida por IL-12, sola o en combinación con el sistema del gen suicida y apoya el uso de la terapia combinada para el tratamiento de tumores de cerebro. Un clon de VPC terapéutico portando el gen de HSV-tk fue también seleccionado para su utilización en protocolos clínicos. Este clon mostró una mayor eficacia antitumoral que la preparación original. Finalmente, se construyeron y caracterizaron nuevos vectores para su uso en terapia génica, basados en sistemas regulables e inducibles por condiciones exógenas (tetraciclina) y endógenas del tumor (hipoxia tumoral).