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La porfobilinógeno-deaminasa (PBG-D) cataliza la condensación de cuatro moléculas de porfobilinógeno (PBG) para formar el hidroximetilbilano, el cual en presencia de la enzima isomerasa, origina el uroporfirinógeno m, precursor fisiológico en la síntesis de hemos, clorofilas y corrinas. Dado que bajo ciertas condiciones, la PBG-D podría actuar como segundo sitio de regulación, se resolvió estudiar la PBG-D de hígado y de riñón de rata, con un enfoque cinético. Se purificaron ambas enzimas empleando las siguientes técnicas: fraccionamiento con sulfato de amonio, filtración molecular (Sephadex G-lOO), intercambio aniónico (Q-Sepharosa) y cromatografla de afinidad (Blue Sepharosa). La purificación a homogeneidad de la enzima renal se logró mediante una electroforesis preparativa, que mostró una sola banda proteica con actividad, confirmada a través de Western blots. La actividad máxima se detectó en incubaciones a 65°C, a pH’s 7,8 y 8,2 con una energía de activación calculada de 16,8 kcal/mol y 19,3 kcal/mol y se detemiinaron las masas moleculares relativas: 41,7 ± 4,2 kDa y 39,8 ± 4,0 kDa para las enzimas hepática y renal respectivamente. La PBG-D de hígado de rata presenta un comportamiento michaeliano, con valores aparentes de Km y Vm de 12 ± 1,4 μM y 17,0 ± l,4 pmoles/mg.min. respectivamente y un n de Hill de 1, determinados a pH 8,2 y a 37°C. Estudios cinéticos revelaron que los iones Mg2+ (0-80 mM) y fosfato (0-20 mM) actúan como inhibidores incompetitivos, mientras que el amonio (0-50 mM) y la sulfarnerazina (0-2,0 mM) son inhidores no competitivos. En cambio, el ácido fólico (0-2,0 mM) actúa como un activador no esencial de la reacción. Para la enzima renal, los estudios cinéticos mostraron un comportamiento complejo, con una primera zona de saturación comprendida entre 5,0 y 7,0 μM y una segunda a partir de 66-70 μM. Los gráficos de dobles recíprocas son no lineales y exhiben un carácter bimodal que se traduce en dos constantes aparentes de afinidad, Km1: 0,8 ± 0,1 μM y Km2: 3,5 ± 0,4 μM. Comparando estas constantes cinéticas con las correspondientes para médula (Km: 0,8 ± 0,1 μM y Km2: 3,3 ± 0,4 μM) y corteza renal (Km: 0,9 ± 0,1 μM y Km2: 5,1 ± 0,6 μM), se sugiere que no existirian dos poblaciones proteicas distintas confinadas en diferentes estructuras. Además, la banda única obtenida (pI: 4,9) mediante la técnica de isoelectroenfoque, permitió descartar la presencia de isofonnas en riñón. Estudios cinéticos revelaron que el ion sodio (0-2,0 M) produjo un desplazamiento del punto de inflexión hasta obtener gráficos de inversas con una sola pendiente. A altas concentraciones de sustrato (7-66 uM) los iones Mg2+ (0-50 mM), fosfato (0-40 mM) y amonio (0-300 mM) actúan como inhibidores no competitivos. A bajas concentraciones de sustrato (0,8-7,0 pM) el Mg2+ es un inhibidor incompetitivo, el fosfato presenta un efecto dual y el amonio desplaza el punto de inflexión conforme aumenta su concentración. Estudios de inhibición realizados con PCMB, NEMI y DTNB demostraron la presencia de aminoácidos cisteína en el sitio activo, lo cual fue confirmado a través de estudios de grupos ionizables en la enzima y en los complejos enzima-sustrato. Se propone para la enzima renal, la existencia de por lo menos dos estados confonnacionales diferentes inducidos en el mismo sitio catalítico, ya sea por la unión del sustrato PBG o la no liberación del producto amonio o de ambos. La presencia de tales cambios confonnacionales permitiría la continuidad en la unión de las otras moléculas de PBG al sitio S, en presencia de intermediarios ES1, ES2 o ES3 en el sitio C, lo que originaria una diferente afinidad y actividad catalítr'ca final. Estos reordenamientos podrian producir finalmente cambios en los pasos limitantes de la reacción, lo cual sucedería a diferentes concentraciones de sustrato y daría lugar entonces a distintas constantes cinéticas.

La Terapia Fotodinámica (TFD) es utilizada para el tratamiento del cáncer y otras patologías no malignas. Se basa en la administración un compuesto fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido maligno y al recibir fotones interactúa con el O2 produciendo especies reactivas del oxígeno (ROS), que son altamente tóxicas y desencadenan la muerte celular. La administración exógena del ácido 5-aminolevúlico (ALA), precursor biológico de la síntesis de los tetrapirroles, induce la acumulación de protoporfirina IX (PpIX), un FS muy eficiente. La quimioterapia administrada en altas dosis, seguida del transplante autólogo de médula ósea es una de las modalidades terapéuticas más utilizadas para el tratamiento de la leucemia. Sin embargo, una pequeña proporción de células leucémicas indiferenciadas que se encuentran en un estado quiescente, pueden resultar resistentes a la quimioterapia y ser reinsertadas en el paciente luego del transplante. Por este motivo actualmente se estudian métodos de purgado potencialmente efectivos para eliminar a las células malignas remanentes. Además, el uso de quimioterapia presenta otras limitaciones como el desarrollo de fenotipos celulares resistentes a drogas y efectos secundarios no deseados. En esta tesis hemos estudiado los efectos de la TFD basada en ALA (TFD-ALA) en tres líneas celulares leucémicas murinas, LBR-, sensible a drogas de quimioterapia, LBR-D160 y LBR-V160, resistentes a doxorubicina (DOX) y vincristina (DOX), respectivamente. Para ello evaluamos la síntesis y acumulación de PpIX sintetizada a partir de ALA, y observamos que en las tres líneas estudiadas esta síntesis aumentó en función de la concentración y del tiempo de incubación con ALA. Estudios de microscopía confocal indicaron que las mitocondrias son el principal sitio de localización de PpIX. Mediante estudios de viabilidad celular demostramos la eficacia de la TFD-ALA en las tres líneas celulares, indicando la falta de resistencia cruzada en el caso de las líneas resistentes a drogas de quimioterapia. Por otra parte estudiamos los mecanismos involucrados en la muerte celular producida por la TFD, donde observamos un aumento en los parámetros de estrés oxidativo como la despolarización de la membrana mitocondrial, la producción de oxígeno singulete y de anión superóxido, indicando la importancia de las mitocondrias en los efectos de la TFD. El análisis de parámetros tanto morfológicos como bioquímicos demostró la predominancia de apoptosis como principal mecanismo de muerte, en particular a través de la vía intrínseca, lo que concuerda con el rol activo de las mitocondrias previamente mencionado. Evaluamos además los efectos al combinar la TFD-ALA con los agentes antineoplásicos DOX y VCR, en un modelo in vitro in vivo, utilizando la línea LBR-. En ambos casos observamos un beneficio significativo al utilizar las terapias combinadas, evidenciando la ventaja de esta modalidad frente a las terapias utilizadas en forma independiente. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran el beneficio potencial de utilizar la TFD-ALA como método de purgado de la médula ósea de pacientes con leucemia, especialmente para eliminar fenotipos resistentes a drogas. Además, los estudios utilizando las terapias combinadas indican la posibilidad de disminuir las dosis de drogas de quimioterapia, minimizando así las limitaciones ocasionadas por este tratamiento.